La détection des protéines liant l'ARN par<em> In vitro</em> ARN Pull-down en adipocytes Culture
Summary
Un protocole de pull-down ARN est optimisée ici pour la détection d'interactions entre les protéines liant l'ARN (RBP) et non codantes ainsi que ARNs codant. Un fragment d'ARN du récepteur des androgènes (AR) a été utilisé comme un exemple pour montrer comment récupérer son RBP de lysat des adipocytes bruns primaires.
Abstract
protéines liant l'ARN (RBP) apparaissent comme une couche de réglementation dans le développement et la fonction du tissu adipeux. RBP jouent un rôle clé dans la régulation de l'expression des gènes au niveau post-transcriptionnels en affectant la stabilité et translationnelle efficacité des ARNm cibles. technique de pull-down ARN a été largement utilisé pour étudier les interactions ARN-protéine, qui est nécessaire pour élucider le mécanisme sous-jacent fonction »ainsi que de longs ARN non-codants 'RBP (lncRNAs). Cependant, l'abondance élevée en lipides dans les adipocytes pose un défi technique à la réalisation de cette expérience. Voici un protocole de pull-down ARN détaillée est optimisée pour la culture des adipocytes primaires. Un fragment d'ARN à partir de (AR) région 3 'non traduite du récepteur des androgènes (3'UTR) contenant un elementwas cyclase-uridylate riche utilisés comme un exemple pour montrer comment récupérer son partenaire de RBP, protéine HuR, de adipocyte lysat. Le procédé décrit ici peut être appliqué pour détecter les interactions entreRBP et ARNs non codants, ainsi qu'entre les pratiques commerciales restrictives et ARNs codant.
Introduction
RBP sont des protéines qui se lient à l'ARN double ou simple brin dans les cellules et participent à la formation de complexes ARN-protéine. RBP peuvent lier une variété d'espèces d'ARN, y compris l'ARNm et de longues ARN non codantes (lncRNAs), et exercer leur influence au niveau post-transcriptionnel. Les deux RBP et lncRNAs apparaissent comme nouveaux régulateurs dans le développement du tissu adipeux et de la fonction 1,2,3. Pour comprendre le mécanisme de RBP- et la régulation du lncRNA médiée par des voies cellulaires, il est souvent nécessaire de détecter l'interaction entre une molécule d'ARN spécifique et un ou plusieurs RBP, et, parfois, d'identifier la gamme complète des partenaires protéiques d'un ARN transcription. Cependant, l'expérience peut être difficile en raison de la forte teneur en lipides dans les adipocytes. Le protocole de pull-down de l' ARN est décrit ici peut être utilisé pour récupérer les partenaires protéiques d'un ARN spécifique à partir de lysats de cultures primaires adipocytes 4,5.
Justification de ce protocol se résume comme suit. Un appât à ARN est transcrit in vitro à partir d' une matrice d'ADN marqué à la biotine et conjugué à des billes magnétiques revêtues de streptavidine 4. L'amorce d'ARN est mis en incubation avec des lysats cellulaires pour permettre la formation de complexes ARN-protéine, qui sont ensuite abaissés sur un support magnétique. Plus précisément, le protocole de pull-down de l' ARN décrit ci – dessous utilise un fragment d'ARN à partir d' AR 3'UTR comme appât pour récupérer la protéine Hur, une RBP universellement exprimée lié au 3'UTR des ARNm 6,7, à partir theadipocytelysate de la culture primaire. Afin de tester la spécificité de liaison de cet essai, une RNAas non pertinents ainsi que des billes de streptavidine blanc est inclus comme témoin. Ce protocole est compatible avec Western blot ou par spectrométrie de masse (MS) pour confirmer la capture d'un RBP spécifique ou d'identifier le plein répertoire des pratiques commerciales restrictives, respectivement 8 capturés.
Plusieurs techniques sont disponibles pour étudier les interactions ARN-protéines. Pour révéler ARNs liés par un RBP donné, RIP (ARN immunoprécipitation) et CLIP (réticulation UV et immunoprécipitation) peut être appliquée. En revanche, pour identifier les partenaires protéiques d'un ARN donné, ARN pull-down, CHIRP (chromatine isolement par la purification de l'ARN), GRAPHIQUE (capture analyse d'hybridation de cibles d'ARN) et RAP (purification antisens d'ARN) peut être appliqué. En comparaison avec les plus tardifs, technique déroulant ARN prend moins d'efforts pour mettre en place. Il peut être utilisé pour capturer des protéines in vitro et in vivo. L'approche in vivo de l' ARN pull-down, qui est techniquement plus difficile que son homologue in vitro, préserve les interactions ARN-protéine par réticulation dans les cellules, capture des ARN aptamères marqués d'intérêt à partir de cellules, et détecte ensuite RBP liés. ARN pull-down peut être utilisé pour enrichir faible RBP abondantes, et d'isoler et d' identifier les complexes ARN-protéine qui ont des rôles fonctionnels divers dans le contrôle de la régulation cellulaire 9,10 </sup>.
Protocol
Representative Results
Discussion
lncRNAs et RBP ont un rôle vital dans la santé et la maladie, mais les mécanismes moléculaires de ces molécules sont mal comprises. Identification des protéines qui interagissent avec des molécules lncRNA est une étape clé pour élucider les mécanismes de régulation. Enrichissement du RBP par le système de dosage pull-down de l'ARN est basé sur la capture dans une solution d'interaction complexe de sorte que les protéines à partir d'un lysat de cellules peuvent être extraits de manière séle…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par Singapour NRF bourse (NRF-2011NRF-NRFF001-025) ainsi que CBRG (NMRC / CBRG / 0070/2014).
Materials
| Major materials used in this study. | |||
| MEGAscript kit | Ambion | ||
| Biotin-14-CTP | Invitrogen | ||
| NucAway spin columns | Ambion | ||
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | ||
| HuR (3A2) mouse monoclonal antibody (sc-5261) | Santa Cruz Biotechnology | ||
| Goat anti-mouse IgG-HRP(sc-2005) | Santa Cruz Biotechnology | ||
| Hypure Molecular Biology Grade Water (nuclease-free) | HyClone | ||
| Phosphate Buffer Saline (1×PBS) | HyClone | ||
| RNase inhibitor | Bioline | ||
| Protease inhibitor | Sigma | ||
| Pfu Turbo DNA polymerase | Agilent Technologies | ||
| TRIsure | Bioline | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Major equipment used in this study. | |||
| Sorvall Legend Micro 21R centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Sorvall Legend X1R centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Bio-Rad T100 thermal cycler | Bio-Rad | ||
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| BOECO rotator Multi Bio RS-24 | BOECO,Germany | ||
| Protein gel electrophoresis and blotting apparatus | Bio-Rad | ||
| DynaMag-2 magnet | Life Technologies |
Referenzen
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