Protocollo per la conversione diretta dei fibroblasti murini embrionali in trofoblasto cellule staminali
Summary
Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.
Abstract
cellule staminali Trophoblast (TSC) sono una conseguenza della prima decisione destino cellulare in sviluppo dei mammiferi. Essi possono essere coltivate in vitro, mantenendo la capacità di auto-rinnovarsi e di differenziarsi in tutti i sottotipi del lineage trofoblasto, equivalenti in vivo staminali popolazione cellulare dando luogo alla parte fetale della placenta. Pertanto, TSC offrono un modello unico per studiare lo sviluppo placentare ed embrionale rispetto a extra-embrionali decisione destino della cellula in vitro. Dal stadio di blastocisti in poi, una barriera epigenetica distinta composto da metilazione del DNA e degli istoni modifiche separa ermeticamente entrambe le linee. Qui, descriviamo un protocollo per superare questa barriera completamente lignaggio da transitori sovra-espressione del trofoblasto regolatori chiave Tfap2c, GATA3, Eomes e ETS2 in fibroblasti embrionali murini. Le cellule staminali del trofoblasto indotte sono in grado di auto-rinnovarsi e sono quasi identiche a blastocisti di cellule staminali derivate trofoblasto in termini di morfologia, l'espressione del gene marcatore e modello di metilazione. Funzionale in vitro e in vivo confermano che queste cellule sono in grado di differenziarsi lungo lignaggio trofoblasto generare cellule giganti poliploide trofoblasto e chimerizing la placenta quando iniettato in blastocisti. L'induzione di cellule staminali dal tessuto trofoblasto somatica apre nuove strade per studiare le caratteristiche genetiche ed epigenetiche di questo lignaggio extra-embrionale e offre la possibilità di generare linee di cellule staminali trofoblasto senza distruggere l'embrione rispettivo.
Introduction
Recentemente, uno studio di confronto diversi approcci di topo cellule staminali embrionali di trofoblasto conversione delle cellule staminali ha rivelato che in tutti i sistemi analizzati, la conversione lignaggio è rimasto incompleto. Invece di cellule staminali indotte (trofoblasto) iTSCs cosiddette staminali trofoblasto cellule simili alle cellule sono stati generati conservando un ricordo del destino delle cellule di origine 1. Qui, abbiamo seguito un approccio diverso di generazione ITSC. Simile a l'induzione diretta di cellule staminali pluripotenti da murine fibroblasti embrionali (MEF) 2, iTSCs sono stati convertiti direttamente dal tessuto somatica differenziata. In primo luogo, abbiamo identificato 12 fattori che inducono candidati TSC destino quando sovraespresso in MEF. In seguito, i fattori Tfap2c, GATA3, Eomes e ETS2 sono stati identificati per essere necessaria e sufficiente per l'induzione ITSC 3. Allo stesso tempo, un altro gruppo ha trovato modo indipendente Tfap2c, GATA3 e Eomes essere sufficiente per convertire MEF in iTSCs. Tuttavia, in talestudio, il tempo richiesto per l'espressione del transgene è notevolmente più lungo rispetto al nostro studio, che indica diverse cinetiche di conversione, quando ETS2 è assente dal transdifferenziamento cocktail 4.
Siero fetale bovino convenzionale (FBS) contenente coltura di cellule staminali del trofoblasto blastocisti derivate indotte e si basa sulla presenza di fattori di crescita secreti dal MEF inattivati 5,6. Durante l'induzione ITSC, questi fattori sono forniti da MEF, che non hanno la piena combinazione di transgeni e non sono sottoposti a transdifferenziamento. Tuttavia, una volta singole colonie ITSC sono sub-coltura, richiedono mezzi di comunicazione, che è stato condizionato dal MEF crescita inattivati. Da lì in poi, iTSCs possono essere coltivate e trattati come blastocisti derivate TSC secondo protocolli standard. Da segnalare, in contrasto con Tanaka et al. 5, abbiamo quotidianamente cultura TSC e iTSCs senza gelatinizzanti piatti di coltura cellulare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il 4 fattore (Tfap2c, GATA3, Eomes, ETS2) protocollo transdifferenziazione basato qui presentata offre un metodo affidabile per generare fedelmente convertito iTSCs da fibroblasti embrionali di topo. Inoltre, il metodo è applicabile anche per i fibroblasti coda post-natale, anche se con un calo di efficienza rispetto ai fibroblasti embrionali 3. In generale, la qualità dei fibroblasti primari è un fattore critico di esito transdifferenziazione e occorre prestare attenzione a utilizzare le cellule di passag…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-10G | Dissolve in sterile PBS, prepare 2 mg/ml stock solution. Store aliquots at -20°C |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628-25G | Prepare 25 mM stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20°C |
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Prepare 8 mg/ml stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20°C |
| human recombinant Fibroblast Growth Factor 4 | ReliaTech | 300-131L | Dissolve in sterile 0.1% BSA in PBS, prepare 25 µg/ml stock solution. Store aliquots at -80°C |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving in sterile PBS. Store aliquots at -80°C |
| ProFection Mammalian Transfection System | Promega | E1200 | |
| PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 1419-094 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 31966-021 | |
| RPMI 1640, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 31870-025 | |
| Advanced DMEM (1x) | ThermoFisher Scientific | 12491-015 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071.03IR | |
| Surfactant-free cellulose acetate-membrane filter | Corning | 431220 | |
| Non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140-035 | |
| Penicillin Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360-039 | |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030-24 | |
| 2-Mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350-010 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), cell culture grade | Panreac AppliChem GmbH | A3672,0100 | |
| pLV-tetO-Tfap2c | Addgene | 70269 | |
| pLV-tetO-Gata3 | Addgene | 70270 | |
| pLV-tetO-Eomes | Addgene | 70271 | |
| pLV-tetO-Ets2 | Addgene | 70272 | |
| pLV-tetO-mCherry | Addgene | 70273 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| FUdeltaGW-rtTA | Addgene | 19780 | |
| Mice B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7 | JAX Mice | 6965 | |
| 129S2SV | Charles River | 129 |
Referenzen
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