这个修改后的提取方法提高了从组织病理学组织块的兴趣更精确的目标区域的RNA和DNA的产量。
Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.
基因组生物标志物的研究旨在确定分子相关因素能够准确和可靠地反映疾病状况,并且在临床上有用的方式这样做。1生物标志物的开发是在良好的注释组织样品的回顾性分析依赖。患病的和正常组织样品储存或者作为新鲜冷冻组织专门生物库或作为临床档案福尔马林固定石蜡包埋的组织(FFPET)块。新鲜冷冻组织允许高质量的核酸提取,并已广泛地应用于基因组生物标志物发现的研究。2,3然而,更少的组织样品中的生物库可用,并研究这种组织朝较大的样品,不寻常的类别引入了偏压病,并且在以更大的能力,以银行组织专业中心看到患者的4 FFPET,相反,是用于患病的人及动物组织的默认存储方法。虽然FFPET块维持细胞米orphology,固定过程交联的其他细胞成分的核酸。交联的RNA和DNA是可恢复的,但只在退化,高度分散的形式。5,6-然而,这些DNA和RNA片段适合于分析由扩阵列测定法,包括基因表达,DNA的甲基化和有针对性的测序。 7,8-要利用这个机会在大数量和品种可用于研究FFPET的,有需要一种有效和可靠的提取方案。
生物标志物研究的组织有很大一部分集中于癌症。像其他类型的病变组织,癌组织往往显示了在细胞保存和细胞类型显著区域异质性。因为生物标记研究依赖于与分子功能病变组织的组分相关的能力,此过程中的关键步骤是组织的精确收获是保存完好,并富集对于disease正在研究中。在FFPET两个富集技术通常用于:激光捕获显微切割(LCM),和切片机切片。 LCM能够实现高度集中的组织收获,可用于在异构组织中分离出特定的,保存完好的细胞类型9,10然而,LCM需要昂贵的设备,是过于耗时大量样品。切片机切片是一种更广泛使用的过程,其中薄片是从FFPET块切11,12切片机切段通常包括组织是在细胞保存异构( 例如 ,坏死与保存完好)和成分( 如癌症与良性实质),因此可能导致的单独研究分子的特性最好的同质化。因此,存在需要一种丰富了感兴趣的细胞的高通量方法。第三种方法中,从FFPET芯核酸的分离,提供了这种富集,是适合于高通过量hput协议,并已被他人使用分离从分离组织芯的RNA或DNA。7,13,14
许多出版的协议指定从FFPET( 表1)中提取核酸的方法。然而,在RNA和DNA是从相同的组织中提取的协议已经被用于切片的组织切片进行了优化,但不用于组织芯。15,16同样,公布的协议而提供更高的组织特异性,或者通过组织芯或滑动microdissections,指定程序为提取DNA,但不RNA。7,17这里,对于DNA和RNA从相同的组织核心的双提取一个优化的协议是证明。组织核心是通过插入组织微阵列(TMA)成拳映射到FFPET块地区的利益收获。映射由注释用记号笔显微镜载玻片和注释传送到相应的FFPE的表面进行Ť块( 图1)。
在此之前的工作,促成该协议的发展包括一些市售的核酸提取系统的比较。在这种比较,修改商业协议,如下所述提供最高的DNA和RNA的产率和质量(Selvarajah 等人 , 在准备 )。组织核心比通常FFPET提取方案11,12,14,18用的5-10微米的微米切片厚– 20,并且可以包含更多的不同量石蜡。为了弥补这一点,脱蜡通过重复二甲苯和乙醇处理,并通过引入电动均化步骤( 图1)提高。此外,蛋白酶K消化时间被延长以增加DNA产量。总体来说,这个协议是符合成本效益,使在La疾病的分子和组织病理学特征之间建立联系RGE,以及表征的人群。其全部的协议能够可靠2天内进行,其中包括3小时动手时,很少需要专门的或昂贵的设备。
在一步一步协议是以下简称制造商的方案的一个修改的版本。21请参见材料/设备的表针对特定试剂,设备和制造商。
用于从感兴趣的组织区域的DNA和RNA的成功提取,准确核化是至关重要的。这个协议描述了使用组织冲床以分离0.6毫米直径铁心和概述用于从显微镜传输符号滑动以对应FFPET块的过程。进行必要的修改,以生产商的方案,以有效地提取从内核核酸,这是大约比的量,协议是预期的切片机切片厚50倍。由于芯可以包含相对更石蜡组织切片,通过反复二甲苯和乙醇处理步骤芯有效脱蜡被要求。的脱蜡后步骤的成功取决于适当的机械组织核心的同质化和高效的蛋白酶K消化。能够进行蛋白酶K消化的进一步优化。
值得一提的是,此方法鉴定块的表面上的兴趣外资企业领域,如在对应的组织病理学载玻片识别。由于核心收成组织,可能是深3或4毫米,这个协议的用户可能会关注什么细胞或组织奠定了块表面之下。虽然这是一个有效的关注,多个研究(参照27中综述)已证明组织核心忠实代表病理组织块的组织学和分子的特性,尤其是当重复或三次重复芯从感兴趣的区域进行采样。
如在该协议通过的修改商业提取试剂盒使DNA和RNA从相同的组织的并发萃取,协议节省了宝贵的生物材料,并允许从同一样品在两个所得核酸之间的直接比较。 RNA和DNA的提取同期减少了劳动力和组织消耗了一半,并使基因expr的精确综合分析分裂国家,以及在DNA中发现的表观遗传和基因的功能。因为RNA和DNA从这些代表性组织核心的产率通常超过分别600和300毫微克,并且由于大多数当前PCR和下一代测序应用通常需要10-100纳克,大部分由该协议纯化样品应提供足够的材质为几个下游检测。此协议已被证明是在整个独立的实验室可再现(Selvarajah 等人 , 在准备)。这个协议的RNA是足够的质量,使用任一RT-PCR或一个流行多分析平台的基因表达分析,及DNA的甲基化特异性PCR测定表现良好。旨在评估回收的核酸下一代测序工具未来的研究是必要的。
因此,若干修改对市售的协议,设计为薄FFPET部分制成,使得它适合初学者r处的RNA和DNA的从0.6毫米FFPET芯共萃取。该协议证明了大队列的前列腺癌样本和在从乳房,脑,膀胱癌有限的一组样品的一致的高产量。总体而言,该协议应允许用户进行大型注释良好的组织聚集针对性基因为基础的分析。重要的是,该协议允许在FFPET感兴趣区域的有效集中的采样的,相对小动手时,对于大多数下游应用足够高的产率。
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by a team grant from Movember/Prostate Cancer Canada to JMSB, DMB, PCP, and JL, and by the Ontario Institute of Cancer Research (JMSB, DMB, and PCP) and Motorcycle Ride for Dad Kingston/University Hospitals Kingston Foundation/Kingston General Hospital (DMB, PCP).
Plastic paraffin film, "Parafilm 'M'" | Bemis | RK-06720-40 | Any generic paraffin film will work as a substitute |
Sodium Hypochlorite, "Ultra Bleach" | Likewise | 53-2879-2 | Any generic bleach will work as a substitute. Hazardous material that can cause burns on contact. |
Molecular biology grade absolute ethanol | Fisher BioReagents | BP2818-500 | Sigma-Aldrich E7023 suffices as a substitute |
Molecular Grade H2O | G-Biosciences | 786-293 | Sigma W4502 suffices, as well as any other brand of molecular grade H2O |
0.6mm Punch Set for Beecher Instruments | Estigen | MPO6[Yellow] | Make sure to use the red receiver punch from the set |
Fine point permanent marker | Sharpie | 10365796S | Using the marker on FFPE tissues causes it to dry out quickly, so several may be required |
FFPE tissue block | |||
Stained tissue slide corresponding to FFPE block | |||
1.5 mL Micro-Centrifuge Tubes | Fisher BioReagents | 05-408-137 | |
2.0 mL Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes) | Eppendorf | 22431048 | |
1.5 mL Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes) | Eppendorf | 22431021 | |
Histology Xylene | VWR | CA 95057-822 | Fisher Scientific X5-500 suffices as a substitute |
Molecular Biology Grade 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
AllPrep FFPE DNA/RNA Kit | Qiagen | 80234 | Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21 |
Buffers: RLT, FRN, RPE, ATL, AL, AW1, AW2, DNaseI solution | Qiagen | 80234 | Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21 |
Temperature stable proteinase K | Qiagen | 80234 | |
High potency proteinase K | Invitrogen | 25530-049 | Invitrogen 25530-015 suffices as a substitute |
RNAse neutralizing solution (Rnase AWAY) | Molecular BioProducts | 7003 | |
RNaseA 100mg/mL | Qiagen | 19101 | |
BD Integra Syringe 3mL 21G x 1/2 | BD | 305274 | |
Motorized tissue homogenizer (TissueRuptor) | Qiagen | 9001271 | Fisher Scientific 14-261-29 suffices as a substitute |
-20°C and -80°C Laboratory Freezer | |||
Micro-Centrifuge with rotor for 2mL tubes | |||
Digital Vortex Mixer | |||
Pipettes and filter tips | |||
Heating blocks or water baths | |||
Tris Hydrochloride | Amresco | 0234 | |
Sodium Chloride | Amresco | 0241 | |
Anhydrous Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma | L4509 | |
Acrodisc 25mm syring filters with 0.45 um Supor membrane | Pall | PN 4614 | |
Syringe with retracting BD PrecisionGlide needle 3mL | BD Integra | 305274 | |
Hydrochloric Acid | BDH | 3026 | |
Multianalyte gene expression platfrom (nCounter ® CAE codeset and Nanostring nCounter platform) | Nanostring nCounter platform, Nanostring | ||
Fluorometric nucleic acid quantification (Qubit dsDNA HS Assay Kit and Qubit® RNA BR Assay Kit) | Invitrogen |