친 유성 독소루비신 전구 약물 미셀의 제조 및 특성화
Summary
친 유성 독소루비신 전구 약물의 제조 및 특성화를위한 프로토콜 1,2- distearoyl- SN -glycero -3- phosphoethanolamine- N로드 – [아미노 (폴리에틸렌 글리콜) -2000 (PEG-DSPE) 미셀 설명한다.
Abstract
Micelles have been successfully used for the delivery of anticancer drugs. Amphiphilic polymers form core-shell structured micelles in an aqueous environment through self-assembly. The hydrophobic core of micelles functions as a drug reservoir and encapsulates hydrophobic drugs. The hydrophilic shell prevents the aggregation of micelles and also prolongs their systemic circulation in vivo. In this protocol, we describe a method to synthesize a doxorubicin lipophilic pro-drug, doxorubicin-palmitic acid (DOX-PA), which will enhance drug loading into micelles. A pH-sensitive hydrazone linker was used to conjugate doxorubicin with the lipid, which facilitates the release of free doxorubicin inside cancer cells. Synthesized DOX-PA was purified with a silica gel column using dichloromethane/methanol as the eluent. Purified DOX-PA was analyzed with thin layer chromatography (TLC) and 1H-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (1H-NMR). A film dispersion method was used to prepare DOX-PA loaded DSPE-PEG micelles. In addition, several methods for characterizing micelle formulations are described, including determination of DOX-PA concentration and encapsulation efficiency, measurement of particle size and distribution, and assessment of in vitro anticancer activities. This protocol provides useful information regarding the preparation and characterization of drug-loaded micelles and thus will facilitate the research and development of novel micelle-based cancer nanomedicines.
Introduction
화학 요법은 일반적으로 암의 다양한 형태를 치료하는 데 사용됩니다. 모든 경우 대부분은 화학 요법 약물은 더 많은 생명을 위협 조건, 오심, 설사 등의 관리가 작은 조건에 따라 다를 수 독성 부작용이있다. 대부분의 항암제는 독성이 있기 때문에 정상 조직에 대한이 약의 비 선택적 노출은 필연적으로 독성이 발생합니다. 따라서, 선택적으로 암세포에 약물을 전달할 수있는 치료 방법에 대한 중대한 필요성이있다. 항암제의 투여와 함께 또 다른 문제는 가난한 수용성이다. 일반적으로, 가용 화제는 이러한 난 용성 약물을 수립 할 필요가있다. 그러나, 디메틸 설폭 사이드와 같은 대부분의 가용 화제, (DMSO), 크레 모포 EL 및 폴리 솔 베이트 80 (트윈 80) 간 및 신장 독성, 용혈, 급성 과민 반응 및 말초 신경 병증의 원인이 될 수 있습니다. 1 따라서, 안전하고 생체 적합성 제제는 필요하다 가난한 사람들의 임상 사용LY 수용성 항암제. Nanocarriers은 상기 과제에 대한 약물 전달 시스템을 약속한다. 이 nanocarriers는 리포좀,이 나노 입자, 3 미셀, 4-7 고분자 – 약물 접합체, 8, 무기 물질을 포함한다. 9 몇 나노 의학 제품 (예를 들어, Doxil, 아브 락산 및 Genexol)는 암 환자를 치료하기 위해 규제 기관에 의해 승인되었습니다. (10)
고분자 미셀이 성공적으로 항암제의 전달에 사용 된 나노 크기의 약물 전달 담체를 약속한다. 4-7,11,12 전형적인 고분자 미셀은 자기 조립 공정을 통해 양친 성 중합체로부터 제조된다. 코어 – 쉘 구조 고분자 미셀은 친수성 쉘과 소수성 코어를 포함한다. 친수성 쉘은 입체적으로 미셀을 안정화시키고 혈류에서의 순환을 연장 할 수 있습니다. 소수성 코어는 효과적으로 소수성 D를 캡슐화 할 수 있습니다양탄자. 때문에 미셀 (일반적으로 미만 200 ㎚) 및 장기 순환 속성의 작은 크기, 고분자 미셀이 향상 침투성 및 보존 (EPR) 효과 (수동 종양 타겟팅)을 대상으로 종양을 달성 할 것으로 추정된다.
봉입 안정성은 미셀의 능력을 표적 종양 중요하다. 최적 종양 타겟팅을 달성하기 위해, 미셀은 종양 부위에 도달하기 전에 최소 누설 약물이 아직 신속 암세포를 입력 한 후 약물을 방출한다. 제제의 안정성이 제품 개발의 실행 가능성뿐만 아니라 개발 된 제품의 저장 수명을 결정하기 때문에 또한 제제 안정성, 또한, 제품 개발을위한 필수 요건이다. 최근 많은 노력 전달 담체에 약물의 로딩을 개선하려고했다. 친 유성 전구 약물 접근 지질 나노 입자 에멀젼에 약물 로딩을 개선 탐색 된 전략이다. 13,14 접속사약물과 지질의 ugation 크게 자신의 친 유성을 개선하고 nanocarriers의 친 유성 성분의로드 및 보존을 향상시킬 수 있습니다.
여기서는 친 독소루비신 전구 약물로드 미셀을 제조하는 프로토콜을 기술한다. 우선, 친 유성 약물 독소루비신위한 합성 과정을 설명한다. 이어서, 필름 분산 법 마이셀을 생성하는 프로토콜이 도입된다. 이 방법을 성공적으로 이전 연구에서 사용되었다. 5 DSPE-PEG가 성공적 미셀 약물 전달을 위해 사용 되었기 때문에 미셀을 제조하기위한 담체 물질로서 선택 하였다. (15, 16)는 마지막으로, 미셀을 특성화하는 데 사용되는 여러 가지 시험 관내 분석을 서술 제형은 항암 활성을 평가 하였다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 연구에서 우리는 미셀의 제조를위한 단순한, 신속한 필름 분산 법을 설명한다. 이 방법은, 양친 성 고분자의 자기 조립 특성을 이용한다 (예를 들어 DSPE-PEG)를 수성 환경에서 코어 – 쉘 구조의 미셀을 형성한다. 이 미셀의 제조 방법은 여러 가지 장점을 갖는다. 1. 일반적 리포좀, 나노 입자 및 nanoemulsions. 19 (2)의 제조에 사용되는 (예를 들면 압출 또는 균질화 같은) 복잡한 크기 환?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the following grants: NIH-SC3 grant, NSF-PREM grant, Hampton University Faculty Research Grant. We would like to thank Mrs. Michele A. Cochran at Virginia Institute of Marine Science (VIMS) for the use of the particle size analyzer. We would also like to thank Mrs. Corinne R. Ramaley for reviewing the manuscript.
Materials
| DSPE-PEG2K | Cordenpharm | LP-R4-039 | >95% |
| Doxorubicin | LC Laboratories | D-4000 | >99% |
| Palmitic Acid Hydrazide | TCI AMERICA | P000425G | >98.0% |
| Methanol | ACROS Organics | 610981000 | Anhydrous |
| Methylene chloride | FISHER | D151-4 | 99.90% |
| Methyl sulfoxide-d6 | ACROS Organics | AC320760075 | NMR solvent |
| Trifluoroacetic Acid | ACROS Organics | AC293811000 | 99.50% |
| Silica Gel | FISHER | L-7446 | 230-400 mesh |
| BAKER FLEX TLC PLATES | FISHER | NC9990129 | |
| DPBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| DU 145 Prostate Cancer Cells | ATCC | HTB-81 | |
| MTT | ACROS Organics | 158990050 | 98% |
| RPMI 1640 Medium | MEDIATECH INC | 10041CV | |
| Antibiotic-Antimycotic | LIFE TECHNOLOGIES | 15240062 | 100x stock solution |
| Fetal Bovine Serum | LIFE TECHNOLOGIES | 10437077 | |
| Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy | Varian, Inc | 300 NMR | |
| Büchi R-3 Rotavapor | Buchi | 1103022V1 | Rotary evaporator |
| Ultrasonic Bath | BRANSON ULTRASONICS CORPORATION | CPX952318R | |
| UV-VIS spectrometer Biomate 3 | Thermo Spectronic | ||
| Zetasizer Nano ZS90 | Malvern Instruments | Particle Size Analyer | |
| Microplate Spectrophotometer | Rio-Rad | Benchmark Plus | |
| Cell Culture Incubator | Napco | CO2 6000 | |
| Biological Safety Cabinet | Nuaire | ||
| SigmaPlot | Systat Software, Inc. | Analytical Software | |
| 96-Well Cell Culture Plate | Becton Dickinson | 353072 | |
| Trypsin 0.25% | Corning Cellgro | 25-053-CI |
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