بروتوكول CUBIC يتصور التعبير البروتين في قرار خلية واحدة في كامل الاستعدادات الجلد جبل
Summary
ويصف هذا التقرير بروتوكول مكعب الى توضيح كامل خزعات الجلد سماكة الماوس، وتصور أنماط التعبير البروتين، والخلايا المتكاثرة، وsebocytes في قرار خلية واحدة في 3D. تمكن هذه الطريقة تقييم دقيق لعلم التشريح وعلم الأمراض الجلدية، ومن الظواهر البشرة غير طبيعية في خطوط الماوس المعدلة وراثيا.
Abstract
الجلد هو ضروري لبقائنا. تتكون طبقة البشرة الخارجية للبشرة البيني، وهو ظهارة الحرشفية الطبقية التي تغطي معظم الجسم، والزوائد البشرة مثل بصيلات الشعر والغدد العرقية. البشرة يخضع تجديد في جميع مراحل الحياة، واستجابة لإصابات. يتم تمكين هذا عن طريق K14، معربا عن القاعدية البشرة السكان الجذعية / خلايا السلف التي تنظم بإحكام من قبل آليات تنظيمية متعددة نشطة داخل البشرة وبين البشرة والأدمة. توضح هذه المقالة طريقة بسيطة لتوضيح كامل خزعات الجلد سماكة الماوس، وتصور أنماط التعبير البروتين K14، Ki67 المعنون باسم الخلايا المتكاثرة، وصفت النيل الأحمر sebocytes، ووضع العلامات النووي دابي في قرار خلية واحدة في 3D. تمكن هذه الطريقة تقييم دقيق وتقدير من الجلد التشريح وعلم الأمراض، ومن الظواهر البشرة غير طبيعية في خطوط الماوس المعدلة وراثيا. بروتوكول CUBIC هو اله أفضل وسيلة متاحة حتى الآن لتحقيق التفاعلات الجزيئية والخلوية في خزعات الجلد سمك كامل في قرار خلية واحدة.
Introduction
الجلد هو ضروري لبقائنا. وهو يتألف من ثلاث طبقات رئيسية البشرة الخارجية، الأدمة واللحمة. البشرة هي الأنسجة التجدد للغاية. وهو ظهارة طبقية الحرشفية، وتتألف في معظمها من الخلايا الكيراتينية. يولدون الخلايا الكيراتينية في الطبقة القاعدية، والتحرك صعودا من خلال طبقات suprabasal بينما التفريق، وفي نهاية المطاف يتم تسليط هم في الطبقة الخارجية متقرن بعد حوالي شهر من ولادتهم. البشرة تطور عدد من الزوائد بما في بصيلات الشعر والغدد الدهنية. تجديد بصيلات الشعر أيضا بطريقة الدوري في جميع مراحل الحياة 1. يتم تمكين القدرة التجديدية للبشرة بسبب وجود الخلايا الجذعية والسلف التي تقع في الطبقة القاعدية من البشرة البيني وبصيلات الشعر 2.
قد تورطت العديد من مسارات إشارات في التنمية البشرة وتجديدها. بعض هذه تحدث داخلالبشرة فقط، مثل مسار القنفذ. الأحداث يشير أخرى تجري بين الأدمة والبشرة 3. على سبيل المثال، يعتقد أن إشارات WNT من الأدمة إلى أن تكون مهمة لتنمية بصيلات الشعر، وتفرز من قبل الحليمة الأدمية في بداية طور التنامي لتنشيط بصيلات الشعر انتفاخ الجذعية / السلف خلية تكاثر ونمو بصيلات الشعر (4). من المهم أن نفهم الآليات الخلوية والجزيئية التي تتحكم في تطوير البشرة وتجديد لفهم أفضل لكيفية أنها قد تكون منزعجة في أمراض الجلد التجدد مثل سرطان الجلد.
توضح هذه المقالة لير C، B nobstructed يو المطر أنا الكوكتيلات maging وتحليل omputational (المكعب) بروتوكول C 5-7 لتوضيح كامل الاستعدادات الجلد جبل، وتصور أنماط التعبير البروتين في 3 أبعاد على قرار خلية واحدة بواسطة المجهر متحد البؤر. الأسلوب ينطوي على CUBIC غمر الجلدالأنسجة في اثنين من زجاجات المواد الكيميائية على أساس aminoalcohol. هذه الحلول ضبط مؤشرات الانكسار في عينة من الجلد، وترك الأنسجة شفافة والبروتينات سليمة، مما يسمح للمناعي في قرار خلية واحدة.
باستخدام هذا البروتوكول مكعب، والقاعدية وتكاثر السكان القرنية في البشرة البيني وفي بصيلات الشعر وتصويرها في الخزعات سماكة الجلد كامل من الفئران wildtype باستخدام مكافحة Keratin14 (K14) وأضداد Ki67. وتصور الغدد الدهنية في خزعات الجلد wildtype أيضا باستخدام النيل الأحمر تلطيخ. وأخيرا، تمت مقارنة السكان الخلايا الكيراتينية القاعدية في wildtype والمفرطة التصنع خزعات الجلد YAP2-5SA-ΔC 8.
يتيح هذا البروتوكول CUBIC التقييم البصري للتعبير البروتين في خزعات الجلد سمك كامل في قرار وحيد الخلية، وأداة مهمة لتقدير التشريح ابيديرمي epidermal والعيوب الشكلية في جلد معدلة وراثياالفئران، والتحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية الكامنة وراء تطوير البشرة وتجديدها.
Protocol
Representative Results
Discussion
الآليات التنظيمية السيطرة على تنمية الجلد والتوازن هي الأكثر شيوعا درس في 2D باستخدام باجتزاء الأنسجة وتلطيخ النسيجي أو وضع العلامات مع الأجسام المضادة، والتي تمكن فقط من التقدير محدودة من التشكل الجلد، سكان الخلية أو تعبير البروتين. وقد تم تطوير عدد من الطرق لتحسين…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر استراليا بيو الموارد (معهد جارفان، أستراليا)، ومركز الموارد البيولوجية (نيو ساوث ويلز أستراليا) ورعاية الحيوان وجنة الأخلاقيات لدعم مع التجارب على الحيوانات. وأيد هذا العمل من قبل المجلس الوطني للصحة والأبحاث الطبية من استراليا (مشروع غرانت APP1062720). الدكتور سيزار P. كاناليس غير المستفيدين من منحة دراسية CONICYT-Becas شيلي (# 72101076). السيد باسم Akladios هي المستفيدة من جائزة الدراسات العليا الدولية جامعة نيو ساوث ويلز من أستراليا.
Materials
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6418 | |
| Ethanol 96% (undenaturated) | Chem-supply | UN1170 | |
| Nile Red | Sigma-Aldrich | 72485-100MG | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Roche | 10236276001 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Merck Millipore | 821940 | |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether | Merck Millipore | 648462 | |
| Triton X-100 | Merck Millipore | 648462 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| anti-Keratin14 antibody | Covance | PRB-155P | |
| anti-Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa 594 | Life Technologies | A21207 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Urea | Merck Millipore | 66612 | |
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Merck Millipore | 137002 | |
| Confocal Microscope | Nikon Instruments Inc | Nikon A1 – Confocal Microscope | |
| cruZer6 Face Trimmer | Braun | Braun cruZer6 Face | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 438456 |
Referenzen
- Fuchs, E. Scratching the surface of skin development. Nature. 445 (7130), 834-842 (2007).
- Watt, F. M., Lo Celso, C., Silva-Vargas, V. Epidermal stem cells: an update. Curr Opin Genet Dev. 16 (5), 518-524 (2006).
- Hardy, M. H. The secret life of the hair follicle. Trends Genet. 8 (2), 55-61 (1992).
- Lim, X., Nusse, R. Wnt signaling in skin development, homeostasis, and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (2), (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nat Protoc. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Beverdam, A., Claxton, C., Zhang, X., James, G., Harvey, K. F., Key, B. Yap controls stem/progenitor cell proliferation in the mouse postnatal epidermis. J Invest Dermatol. 133 (6), 1497-1505 (2013).
- Fuchs, E., Green, H. Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte. Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).
- Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).
- Hamilton, E., Potten, C. S. Influence of hair plucking on the turnover time of the epidermal basal layer. Cell Tissue Kinet. 5 (6), 505-517 (1972).
- Morris, R. J., Fischer, S. M., Slaga, T. J. Evidence that a slowly cycling subpopulation of adult murine epidermal cells retains carcinogen. Cancer Res. 46 (6), 3061-3066 (1986).
- Schweizer, J., Marks, F. A developmental study of the distribution and frequency of Langerhans cells in relation to formation of patterning in mouse tail epidermis. J Invest Dermatol. 69 (2), 198-204 (1977).
- Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. J Vis Exp. (88), e51749 (2014).
