Antilichaam Labeling met fluorescente kleurstoffen met behulp van magnetische Proteïne A en Proteïne G Beads
Summary
De on-bead werkwijze voor het labelen van antilichamen met kleine moleculen maakt het kenmerken van een kleine hoeveelheid antilichamen rechtstreeks uit celmedium. Deze methode is geschikt amine en thiol chemie, en kan meerdere monsters tegelijkertijd, handmatig of met geautomatiseerde platforms.
Abstract
Antilichamen die zijn gemerkt met kleine moleculen zoals fluorescerende kleurstoffen, cytostatica en radioactieve tracers zijn essentiële instrumenten in het biomedisch onderzoek, immunodiagnostiek en meer recentelijk als therapeutische middelen. Traditionele methoden voor het labelen van antilichamen met kleine moleculen vereisen gezuiverde antilichamen bij relatief hoge concentratie, betrekking hebben op meerdere dialyse stappen en hebben beperkte verwerkingscapaciteit. Toch zijn er verschillende toepassingen, waaronder het gebied van antilichaam Drug Conjugaten (ADC), zullen profiteren van nieuwe methoden die de etikettering van antilichamen direct van cel media zal toestaan. Dergelijke werkwijzen kunnen toestaan antilichamen worden gescreend in biologisch relevante assays, bijvoorbeeld, de receptor-gemedieerde internalisatie antilichaam assay bij ADCs. Hier beschrijven we een werkwijze (on-bead methode) die kenmerken van kleine hoeveelheden antilichamen maakt rechtstreeks uit celmedium. Deze aanpak maakt gebruik van een hoge capaciteit magnetische proteïne A en proteïne G affiniteit kralen om antilichamen te vangenuit de cel media gevolgd door merken met kleine moleculen met behulp van amine of thiol chemie en daaropvolgende elutie van gelabelde antilichamen. Het nemen van fluorescerende kleurstoffen als surrogaat voor kleine moleculen, tonen we de on-bead etikettering van drie verschillende muis antilichamen direct van cel media met behulp van zowel amine en thiol etikettering chemie. De hoge bindingsaffiniteit van antilichamen aan Proteïne A en Proteïne G zorgt voor een hoge terugwinning en hoge zuiverheid van de gelabelde antilichamen. Bovendien, het gebruik van magnetische korrels kunnen meerdere monsters handmatig worden gehanteerd, waardoor een aanzienlijke verbetering labeling doorvoer.
Introduction
Antilichamen gelabeld met kleine moleculen zijn misschien de meest gebruikte reagentia in de biologie 1,2. Antilichamen gelabeld met fluorescente kleurstoffen en biotine worden veel gebruikt in de beeldvorming, immunoassays, flowcytometrie, Western blots, immuunprecipitatie en onder andere toepassingen 3-6. Radiogelabelde antilichamen 3,7 vinden veel toepassing bij beeldvorming en therapie, antilichamen gelabeld met cytotoxische geneesmiddelen (ADCs) bieden nieuwe mogelijkheden voor de behandeling van kanker, en twee ADCs zijn reeds goedgekeurd voor therapeutisch gebruik 8. Ondanks hun veelvuldig gebruik zijn de methoden voor het labelen van antilichamen verrassend ongewijzigd gebleven en meestal meerdere reacties te betrekken en ontzouting stappen 9-12. Oplossing methoden werken heel goed in gevallen waar slechts een paar antilichamen moeten worden geëtiketteerd en zijn verkrijgbaar in zeer gezuiverde vorm bij hoge concentratie en in voldoende volumes. Voor nieuwere toepassingen zoals ADC, is er eenmoeten antilichamen etiketteren vroeg stadium hybridoma zodat ze kunnen worden gescreend op biologisch relevante eigenschappen, bijvoorbeeld receptor-gemedieerde internalisatie antilichaam 13-16. Voor deze hybridoma stadium monstervolumes beperkt, antilichamen uitgedrukt bij lage concentraties en een aantal monsters zijn groot, dus oplossing gebaseerde labeling niet geschikt zijn.
Ter vereenvoudiging en verbetering van de doorvoer van de traditionele labeling antilichamen gebaseerde methoden, hebben een aantal alternatieve benaderingen voorgesteld 17,18. Een benadering is niet-magnetische proteïne A gebruikt affiniteitskorrels verpakt in kleine kolommen antilichamen gevolgd door de labelingsreactie en elutie van gelabelde en gezuiverd eiwit vangen. Deze methode kan worden gebruikt om antilichamen direct labelen van cel media, is het gebruik van kolommen moeizaam. Een magnetische korrel gebaseerde werkwijze is recentelijk gerapporteerd dat 19 het gebruik van kolommen elimineert en verbetert de doorvoer maar doorde beperkte antilichaambinding capaciteit van de korrels konden alleen lage nanogram tot microgram hoeveelheden van de antilichamen worden gelabeld.
We hebben onlangs ontwikkeld en gebruikt hoge capaciteit magnetische Proteïne A en Proteïne G parels (> 20 mg humaan IgG / ml vaste korrels) antilichamen aanwezig in celmedium met 20 kleine moleculen te labelen. De hoge capaciteit van de korrels maakt tientallen tot honderden microgram antilichaam gemakkelijk worden gemerkt en de snelle respons van de magnetische kralen vereenvoudigt behandeling en verwerking van een groot aantal monsters in parallel. Het gebruik van fluorescerende kleurstoffen als surrogaat voor kleine moleculen, laten we zien dat de methode is compatibel met de etikettering chemie amine en thiol en biedt een hoge terugvorderingen van gemerkt en zeer zuiver antilichamen.
Dit protocol en de bijbehorende video beschrijven on-bead etikettering van muizenantilichamen in de cel media met magnetische Proteïne A en Proteïne G parels. Het protocol isverdeeld in vier delen: Deel 1 beschrijft de verovering van antilichamen op de hiel van biologische monsters. Naar aanleiding van capture, wordt de etikettering van antilichamen met een fluorescerende kleurstof met behulp van amine chemie of met behulp van thiol chemie beschreven in rubriek 2 en deel 3, respectievelijk. Tenslotte worden in hoofdstuk 4 beschrijft de werkwijze voor de berekening van de antilichaamconcentratie en de kleurstof antilichaam verhouding.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het doel van deze studie was om een methode om antilichamen aanwezig in het celmedium bij lage concentraties label, met een verscheidenheid aan kleine moleculen te ontwikkelen. Een dergelijke werkwijze zal een groot aantal antilichamen, tijdens de vroege stadia van antilichaam ontdekking mogelijk, te voorzien van kleine moleculen en gezeefd onder toepassing van een biologisch relevante assay. Een dergelijke test is de receptor-gemedieerde internalisatie antilichaam assay waarbij internalisatie kan variëren tussen…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
None.
Materials
| Magne Protein A Beads | Promega Corporation | G8781 | |
| Magne Protein G Beads | Promega Corporation | G7471 | |
| AlexaFluor 532-SE (Succinimidyl Ester) | Life Technologies | A20001 | |
| AlexaFluor 532-ME (Malemide) | Life Technologies | A10255 | |
| AlexaFluor 647-ME (Maleimide) | Life Technologies | A20347 | |
| Fluorescein-ME (Maleimide) | Life Technologies | F-150 | |
| Magnetic Stand | Promega | Z5332 |
Referenzen
- Colwill, K., Graslund, S. A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome. Nat Methods. 8 (7), 551-558 (2011).
- Silverstein, A. M. Labeled antigens and antibodies: the evolution of magic markers and magic bullets. Nat Immunol. 5 (12), 1211-1217 (2004).
- Day, J. J., et al. Chemically modified antibodies as diagnostic imaging agents. Curr Opin Chem Biol. 14 (6), 803-809 (2010).
- Cunningham, R. E. Overview of flow cytometry and fluorescent probes for flow cytometry. Methods Mol Biol. 588, 319-326 (2010).
- Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. J Vis Exp. (93), e52099 (2014).
- Dundas, C. M., Demonte, D., Park, S. Streptavidin-biotin technology: improvements and innovations in chemical and biological applications. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (21), 9343-9353 (2013).
- Kraeber-Bodere, F., et al. Radioimmunoconjugates for the treatment of cancer. Semin Oncol. 41 (5), 613-622 (2014).
- Leal, M., et al. Antibody-drug conjugates: an emerging modality for the treatment of cancer. Ann N Y Acad Sci. 1321, 41-54 (2014).
- Drachman, J. G., Senter, P. D. Antibody-drug conjugates: the chemistry behind empowering antibodies to fight cancer. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2013, 306-310 (2013).
- Hermanson, G. T. . Bioconjugate Techniques. , 380-382 (1996).
- Shrestha, D., Bagosi, A., Szollosi, J., Jenei, A. Comparative study of the three different fluorophore antibody conjugation strategies. Anal Bioanal Chem. 404 (5), 1449-1463 (2012).
- Vira, S., Mekhedov, E., Humphrey, G., Blank, P. S. Fluorescent-labeled antibodies: Balancing functionality and degree of labeling. Anal Biochem. 402 (2), 146-150 (2010).
- Isa, M., et al. High-throughput screening system to identify small molecules that induce internalization and degradation of HER2. ACS Chem Biol. 9 (10), 2237-2241 (2014).
- Liao-Chan, S., et al. Quantitative assessment of antibody internalization with novel monoclonal antibodies against Alexa fluorophores. PLoS One. 10 (4), e0124708 (2015).
- Riedl, T., van Boxtel, E., Bosch, M., Parren, P. W., Gerritsen, A. F. High-Throughput Screening for Internalizing Antibodies by Homogeneous Fluorescence Imaging of a pH-Activated Probe. J Biomol Screen. 21 (1), 12-23 (2016).
- Nath, N., et al. Homogeneous plate based antibody internalization assay using pH sensor fluorescent dye. J Immunol Methods. 431, 11-21 (2016).
- Lundberg, E., Sundberg, M., Graslund, T., Uhlen, M., Svahn, H. A. A novel method for reproducible fluorescent labeling of small amounts of antibodies on solid phase. J Immunol Methods. 322 (1-2), 40-49 (2007).
- Strachan, E., et al. Solid-phase biotinylation of antibodies. J Mol Recognit. 17 (3), 268-276 (2004).
- Dezfouli, M., et al. Magnetic bead assisted labeling of antibodies at nanogram scale. Proteomics. 14 (1), 14-18 (2014).
- Nath, N., Godat, B., Benink, H., Urh, M. On-bead antibody-small molecule conjugation using high-capacity magnetic beads. J Immunol Methods. 426, 95-103 (2015).
- Lund, L. N., et al. Exploring variation in binding of Protein A and Protein G to immunoglobulin type G by isothermal titration calorimetry. J Mol Recognit. 24 (6), 945-952 (2011).
- Safarik, I., Safarikova, M. Magnetic techniques for the isolation and purification of proteins and peptides. Biomagn Res Technol. 2 (1), 7 (2004).
- Flygare, J. A., Pillow, T. H., Aristoff, P. Antibody-drug conjugates for the treatment of cancer. Chem Biol Drug Des. 81 (1), 113-121 (2013).
- Shen, B. Q., et al. Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nat Biotechnol. 30 (2), 184-189 (2012).
- Acchione, M., Kwon, H., Jochheim, C. M., Atkins, W. M. Impact of linker and conjugation chemistry on antigen binding, Fc receptor binding and thermal stability of model antibody-drug conjugates. MAbs. 4 (3), 362-372 (2012).
