تطبيقات pHluorin لالكمي، الحركية وعالية الإنتاجية تحليل الإلتقام في مهدها الخميرة

Summary

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Abstract

الأخضر بروتين فلوري (GFP) ومشتقاته وتستخدم على نطاق واسع أدوات لدراسة توطين البروتين وديناميكية الأحداث مثل إعادة هيكل الخلية والاتجار حويصلي في الخلايا الحية. وقد تم تطوير منهجيات الكمية باستخدام اندماج GFP خيالية للعديد من التطبيقات؛ ومع ذلك، GFP إلى حد ما على مقاومة التحلل البروتيني، وبالتالي استمرار مضان لها في يحلول / فجوة، والتي يمكن أن تعوق الكمي الاتجار البضائع في مسار التقامي. طريقة بديلة لقياس الإلتقام وبعد التقامي الأحداث الاتجار يجعل من استخدام superecliptic pHluorin، وهو البديل الحساسة درجة الحموضة من GFP أن تطفأ في البيئات الحمضية. الانصهار خيالية من pHluorin إلى ذيل حشوية من البضائع عبر الغشاء البروتينات النتائج في الملطف من مضان عند التأسيس من البضائع إلى الهيئات عديد الحويصلات (MVBs) ونقلهم إلى لمعة يحلول / فجوة. وهكذا، تبريد مضان فجوي يسهل quantifiالموجبة الإلتقام والأحداث في وقت مبكر في مسار التقامي. وتصف هذه الورقة طرق استخدام الشحنات ذات الكلمات الدلالية pHluorin لتقدير حجم الإلتقام عبر المجهر مضان، وكذلك فحوصات على أساس السكان باستخدام التدفق الخلوي.

Introduction

الاتجار حويصلي يلعب دورا هاما في الحفاظ على الهوية عضية وظيفة في الخلايا حقيقية النواة، وهو الآلية الرئيسية لتنظيم البروتين وغشاء تكوين الأجزاء الخلوية الفردية. في غشاء البلازما، والانصهار من الحويصلات exocytic يسلم البروتينات والأغشية جديدة إلى سطح الخلية، في حين الحويصلات الناتجة من خلال الإلتقام إزالة غشاء والبروتينات من سطح لإعادة التدوير لاحق أو استهداف لليحلول. وهكذا، الإلتقام مهم لامتصاص المواد الغذائية والردود على البيئة خارج الخلية. ومتوازنة إيماس والإلتقام لتنظيم مساحة غشاء البلازما، والسماح للدوران من البروتينات التالفة.

وقد حددت الدراسات في الخميرة وخلايا الثدييات عدد كبير من البروتينات المشاركة في الإلتقام، فضلا عن عدة مسارات التقامي التي تعزز استيعاب الشحنات محددة أو هذا الفعل ردا على مجموعة متنوعة من ENشروط vironmental. مسار أفضل درس هو بوساطة بالكلاذرين الإلتقام (CME)، الذي بالكلاذرين والاكسسوار عصاري خلوي البروتينات التجمع في بنية معطف لتحقيق الاستقرار في الحويصلة التقامي الوليدة. وقد أسفرت التجارب في مهدها خميرة خميرة الأفكار الرئيسية في ديناميات والنظام التجنيد للعديد من البروتينات التقامي ^1-3. والجدير بالذكر أن آلية التعليم الطبي المستمر وحفظها للغاية من خلال تطور من هذا القبيل أن الغالبية العظمى من البروتينات المرتبطة التعليم الطبي المستمر في الخميرة لها orthologs الإنسان؛ وبالتالي، فقد كان في مهدها الخميرة أداة مهمة لفهم آليات الإلتقام أن يتم حفظها في حقيقيات النوى أعلى. على سبيل المثال، الدراسات التي تستخدم في مهدها الخميرة قرر أن تشكيل ونضوج هياكل التعليم الطبي المستمر (المشار إليها بقع الأكتين كما القشرية في الخميرة) ينطوي على تجنيد متتابعة من العديد من البروتينات، بدءا بالكلاذرين والبروتينات محول ملزم البضائع، تليها توظيف ملحق التقامي إضافية البروتينات،تفعيل بلمرة الأكتين بوساطة 3 Arp2 /، وتوظيف البروتينات المشاركة في ^1،2 حويصلة انفصال. توظيف البروتينات الآلات التعليم الطبي المستمر لالقشرية بقع الأكتين هو عملية أمر غاية والنمطية، ولقد تم إنشاء نظام دقيق للتجنيد بالنسبة للعديد من البروتينات فيما يتعلق المكونات الأخرى للجهاز التعليم الطبي المستمر. الأهم من ذلك، وقد أكدت الدراسات الحديثة وجود أمر مماثل التوظيف للبروتينات التعليم الطبي المستمر في حفر المغلفة بالكلاذرين في خلايا الثدييات ^4.

بالإضافة إلى التعليم الطبي المستمر، والعديد من أنواع الخلايا تمتلك واحدة أو أكثر التقامي (CIE) مسارات مستقلة بالكلاذرين التي تعتمد على آليات بديلة لتعزيز تشكيل الحويصلة واستيعاب من غشاء البلازما ^5-7. في الخميرة، حددنا مؤخرا طريقا CIE التي تستخدم صغيرة GTPase Rho1 وتفعيل جوانين لها عامل الصرف النوكليوتيدات (GEF)، ROM1 ^8،9. Rho1 ينشط formin Bni1 لتعزيز الأكتين البلمرة ¹0،11، وهو مطلوب لهذا النوع من الإلتقام مستقلة بالكلاذرين في الخميرة ^12. وعلاوة على ذلك، فإن الأسرة α arrestin من البروتينات توظيف يغاز اليوبيكويتين Rsp5 لتعزيز ubiquitination البضائع واستيعاب لاحق من خلال التعليم الطبي المستمر ^13-17، وأيضا تعزيز استيعاب البضائع عبر مسار CIE، ربما من خلال التفاعل المباشر مع البروتينات المشاركة في CIE ^18. مجموعة متنوعة من مسارات CIE توجد أيضا في خلايا الثدييات، بما في ذلك مسارات مستقلة بالكلاذرين وأكلة التي تعتمد على ortholog Rho1، RhoA ^9،19. يساء فهمها دور RhoA في الثدييات CIE. وبالتالي، دراسات في مهدها الخميرة قد توفر رؤى الآلية الإضافية التي تنطبق على CIE الثدييات.

تقدير دقيق للأحداث التقامي يمكن أن توفر معلومات هامة حول دور بروتينات معينة في تنظيم الإلتقام، ويمكن أن تكشف عن آثار الطفرات على استيعاب البضائع أو بروجرسيون من خلال مسار التقامي. لهذا الغرض، ويمكن استخدام طرق البيوكيميائية لمراقبة امتصاص يجند أو لقياس معدلات تدهور البروتينات البضائع التقامي. في الخلايا الحية، مزيج من البروتين الفلوري الأخضر (GFP) ومشتقاته إلى الشحنات من الفائدة يسمح التصور المباشر لنقل البضائع. ومع ذلك، الشحنات GFP الموسومة ذات الاستخدام المحدود للالكمي من الإلتقام لأن GFP مقاوم للتحلل في يحلول (أو فجوة في الخميرة). وعلاوة على ذلك، GFP مضان ليست سوى حساسة جزئيا إلى التغيرات في الرقم الهيدروجيني، ويبقى اكتشافها داخل تجويف تجويف ^20،21. ونتيجة لذلك، مضان من العلامة GFP استمر في فجوة بعد فترة طويلة قد تدهورت ما تبقى من البضائع، وكله الكمي القائم على خلية من كثافة الشحنة قد تكون غير دقيقة بسبب مضان GFP على المدى الطويل في فجوة.

من أجل التغلب على عيوب مضان فجوي GFP، التي قطعناها على أنفسنا قبل استخدام الرقم الهيدروجيني supereclipticluorin، وهو البديل الحساسة درجة الحموضة من GFP تتفلور الزاهية في الرقم الهيدروجيني محايدة، ولكن يفقد مضان في البيئات الحمضية مثل تجويف تجويف / يحلول ^20،22،23. وضع علامة pHluorin على الذيل حشوية من الشحنات التقامي يسمح التصور من الشحنات في غشاء البلازما وعلى الإندوسومات في وقت مبكر، حيث لا يزال علامة pHluorin يتعرض إلى السيتوبلازم (الشكل 1A). كما الإندوسومات في وقت مبكر ناضجة، المطلوبة لحزم النقل (ESCRT) الأجهزة الشحنات مترجمة السطح إلى الحويصلات التي برعم في تجويف الاندوسوم endosomal الفرز المعقدة، وتوليد الهيئات عديد الحويصلات (MVBs) ^24. لالشحنات التي تم إدراجها في الحويصلات MVB الداخلية، العلامة pHluorin تواجه نحو تجويف الحويصلة. ويحمض الحويصلات MVB الداخلية؛ وبالتالي، تفقد الشحنات ذات الكلمات الدلالية pHluorin مضان على الإندوسومات في وقت مبكر لأنها تنضج في MVBs ^20. الانصهار لاحق من MVB مع فجوة يسلم محتويات MVB اللمعيةللتدهور، والعلامات وpHluorin تبقى مروي في البيئة الحامضية للالتجويف فجوة.

تقدم هذه الورقة وصفا تفصيليا لفحوصات التقامي الكمية باستخدام الشحنات مع به pHluorin هيولي في الخميرة. سلالات التعبير عن الشحنات ذات الكلمات الدلالية pHluorin ويمكن استخدامها في المقايسات الحركية و / أو نقطة النهاية، وهذا يتوقف على سلوك خصائص والاتجار في البضائع محددة. وبالإضافة إلى ذلك، بعض الشحنات ذات الكلمات الدلالية pHluorin-قابلة للطرق التحليل الإنتاجية العالية، بما في ذلك التدفق الخلوي. الأهم من ذلك، العلامة pHluorin هو أداة مرنة لدراسة الأحداث التقامي في الخلايا الحية، مما يسمح الكمي لالإلتقام والمقارنة وظيفة التقامي في البرية من نوع وسلالات متحولة.

Protocol

1. حلول والإعلام إعداد ما يلي الأرصدة والإعلام ولوحات: لإعداد 10X YNB، حل 67 غرام من الخميرة قاعدة النيتروجين تفتقر إلى الأحماض الأمينية في 1 لتر من الماء. تعقيم عن طريق التر?…

Representative Results

توطين حالة استقرار وتقدير من البروتين البضائع التقامي المنضوية جوهري Ste3 لإثبات أن الشحنات ذات الكلمات الدلالية pHluorin-يمكن استخدامها لتقدير حجم الإلتقام في الخلايا الحية، توطين GFP خيا…

Discussion

تطبيقات pHluorin لتقدير الأحداث التقامي في خلايا الخميرة يجعل من استخدام الشحنات عبر الغشاء الذي هو تنصهر علامة فلوري إلى ذيل حشوية من البروتين (الشكل 1A). لفحوصات وصفها هنا، الشحنات هي فلوري الزاهية عندما يتعرض العلامة pHluorin إلى بيئات محايدة، ولكن أصبح مروي عندم…

Materials

Adenine	Sigma	A8626-25G	Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
Bacto-agar	Fisher	BP1423-2	Use for preparation of plate media
BD Difco Yeast Nitrogen Base (without amino acids)	BD	291920	Use for preparation of liquid and plate media
Concanavalin A	Sigma	C5275-5MG	Use for coating of chamber slides
Dextrose	Fisher	BP350-1	Use for preparation of liquid and plate media
L-Histidine	Fisher	BP382-100	Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
L-Leucine	Acros	125121000	Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
L-Lysine	Fisher	BP386-100	Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
L-Methionine	Fisher	BP388-100	Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
L-Tryptophan	Fisher	BP395-100	Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
L-Tyrosine	Acros	140641000	Use for preparation of amino acid mixture
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass (8-well)	Thermo Scientific	155411	Use for kinetic and endpoint assays of Mup1-pHluorin internalization
Uracil	Sigma	U0750-100G	Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
Axiovert 200 inverted microscope	Carl Zeiss	Custom Build
100X/1.4 Plan-Apochromat Oil Immersion Objective Lens	Carl Zeiss		Objective should be 100X, 1.4NA or higher
Sensicam	Cooke Corporation		Camera should have 12-bit or higher dynamic range
X-Cite 120PC Q Illumination Source	Excelitas Technologies
Slidebook 5 software	Intelligent Imaging Innovations
ImageJ software	National Institutes of Health		http://imagej.nih.gov/ij/