Het definiëren van de ondergrond hebben voor lipase en fosfolipase Kandidaten
Summary
Many predicted (phospho)lipases are poorly characterized with regard to their substrate specificities and physiological functions. Here we provide a protocol to optimize enzyme activities, search for natural substrates, and propose physiological functions for these enzymes.
Abstract
Micro-organismen produceren een breed scala aan (fosfo) lipasen die worden afgescheiden teneinde externe beschikbare substraten voor het organisme maken. Ook kunnen andere (fosfo) lipasen fysiek gekoppeld aan het producerende organisme veroorzaakt een omzet van intrinsieke lipiden en vaak aanleiding geeft tot een hermodellering van de celmembranen. Hoewel potentiaal (fosfo) lipase kan worden voorspeld met een aantal algoritmen wanneer het gen / eiwitsequentie beschikbaar, experimenteel bewijs van de enzymactiviteiten, substraatspecificiteiten en mogelijke fysiologische functies is vaak niet verkregen. Dit manuscript beschrijft de optimalisatie van testcondities voor potentiële (fosfo) lipasen met onbekende substraatspecificiteiten en hoe deze geoptimaliseerde omstandigheden te gebruiken in de zoektocht naar het natuurlijke substraat van een respectievelijke (fosfo) lipase. Met behulp van kunstmatige chromogene substraten, zoals p-nitrofenyl derivaten kunnen helpen in geringe sporenenzymatische activiteit een voorspeld (fosfo) lipase onder standaardomstandigheden. Hebben ondervonden dergelijke kleine enzymatische activiteit kunnen de verschillende parameters van een enzym assay worden gevarieerd teneinde een efficiëntere hydrolyse van het kunstmatige substraat te verkrijgen. Na de voorwaarden waaronder een enzym werkt goed hebben vastgesteld, moet een groot aantal potentiële natuurlijke substraten worden getest op hun degradatie, een proces dat gevolgd kan worden in dienst verschillende chromatografische methoden. De definitie van substraatspecificiteiten voor nieuwe enzymen, vormt vaak hypothesen voor een mogelijke fysiologische rol van deze enzymen, die vervolgens experimenteel getest worden. Door deze richtlijnen, konden we een fosfolipase C (SMc00171) die fosfatidylcholine aan fosfocholine en diacylglycerol, een cruciale stap voor de verbouwing van membranen in de bacterie Sinorhizobium meliloti upon fosfor randvoorwaarden groei degradeert identificeren. Voor twee voorspelde patatin-zoals fosfolipasen (SMc00930 en SMc01003) van hetzelfde organisme, konden we hun substraat specificiteiten opnieuw te definiëren en te verduidelijken dat SMc01003 is een diacylglycerol lipase.
Introduction
-Glycerol gebaseerde lipiden zoals triacylglycerolen en (glycero) fosfolipiden zijn belangrijke en waarschijnlijk de meest bekende lipide-klassen 1. Triacylglycerolen (TAGs) zijn vetten en oliën, die gewoonlijk fungeren als opslag lipiden en derhalve potentiële energie en koolstofbronnen. TAGs kan worden afgebroken door lipasen die vaak worden uitgescheiden door het producerende organisme externe TAGs verteren en beschikbaar als koolstofbronnen. Ook lipasen zijn uitgebreid bestudeerd in de jaren vanwege hun belangrijke biotechnologische toepassingen 2.
Door hun amfifiele aard en hun bijna-cilindrische vorm, (glycero) fosfolipiden vertonen membraanvormende eigenschappen en meestal vormen de belangrijkste lipide componenten van een dubbellaag membraan 3. In eenvoudige organismen zoals de bacterie Escherichia coli, slechts drie grote kopgroep varianten, fosfatidylglycerol (PG), cardiolipine (CL) en phosphatidylethanolamine (PE) worden aangetroffen, hoewel men dient te beseffen dat elk daarvan kan worden gesubstitueerd met een groot aantal verschillende vetacylketens op de sn-1 of sn-2 positie waardoor een groot aantal verschillende moleculaire species 4 . Andere bacteriën kunnen andere fosfolipiden, naast of in plaats daarvan. Bijvoorbeeld, Sinorhizobium meliloti, een bodem bacterie, die in staat is een stikstoffixerende wortel knobbel symbiose met de peulvruchten alfalfa (Medicago sativa) vormen, bevat naast een tweede zwitterionisch fosfolipide, fosfatidylcholine (PC) PE 5. Ook lipiden zonder fosfor of glycerol kunnen amfifiele en deel uitmaken van de cellulaire membraan. Bijvoorbeeld upon fosfor beperkende groeiomstandigheden, S. meliloti, (glycero) fosfolipiden grotendeels vervangen door membraanlipiden die geen fosfor bevatten, dat wil zeggen, sulfolipiden, ornithine lipiden en diacylglyceryl trimethylhomoserine (DGTS) 6. In bacteriën wordt DGTS gevormd van diacylglycerol (DAG) in een tweestaps route 7 maar de bron voor DAG generatie was niet duidelijk. Pulse-chase experimenten gesuggereerd dat PC een voorloper voor DGTS 8 zou kunnen zijn en het gebruik van de in dit manuscript konden we een fosfolipase C (PLCP, SMc00171) identificeren beschreven methodologie die in het kader van fosfor randvoorwaarden wordt gevormd en welke pc kan omzetten in DAG en fosfocholine 8.
In een afzonderlijke studie, ontdekten we dat een acyl-CoA synthetase (FADD) deficiënte mutant van S. meliloti of Escherichia coli geaccumuleerde vrije vetzuren bij het invoeren van stationaire fase van 9 groei. Hoewel deze vetzuren leek te worden afgeleid van membraanlipiden, werden de precieze bron van de vrije vetzuren of de enzym (en) men ze niet bekend. Nogmaals, in dienst van de strategie die in dit manuscript, twee patatine-achtige 10 (fosfo) lipasen (SMc00930 en SMc01003) die hebben bijgedragen aan de vorming van vrije vetzuren in S. meliloti 11 voorspeld. Verrassenderwijs SMc01003 DAG gebruikt als substraat converteren naar monoacylglycerol en tenslotte glycerol en vrije vetzuren 11. Daarom SMc01003 een DAG lipase (DGLA).
Hoewel een aantal algoritmes aanwezig voor het voorspellen van mogelijke (fosfo) lipasen 12,13, de exacte functie en fysiologische rol meestal niet bekend. Hier schetsen we een protocol, te klonen en overexpressie voorspelde of potentiële (fosfo) lipasen. Dit manuscript uitgelegd hoe enzymbepalingen kunnen worden ontwikkeld en geoptimaliseerd voor de overexpressie (fosfo) lipase met kunstmatige chromogene substraten. We geven voorbeelden hoe met een geoptimaliseerde enzym assay de echte (fosfo) lipase substraat kan worden opgetreden en hoe deze bevindingen ons begrip van microbiële fysiologie zou kunnen verrijken.
Protocol
Representative Results
Discussion
In de afgelopen 20 jaar hebben genomen van vele organismen gesequenced en hoewel een schat aan genoomsequentie gegevens zijn gegenereerd, wordt de functionele interpretatie achterstand en belemmert daardoor ons begrip van de werking van het genoom. Genfuncties in het genoom worden vaak toegewezen op basis van similariteit met genen van bekende functie of voorkomen van geconserveerde motieven. De precieze functie van een bepaald gen vaak niet bekend. Vooral voorspelde structurele genen voor enzymen kunnen gemakkelijk met…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van Consejo Nacional de Ciencias y Tecnología-México (CONACyT-Mexico) (82.614, 153.998, 253.549 en 178.359 in Investigación Científica Básica evenals 118 in Investigación en Fronteras de la Ciencia) en vanaf Dirección General de Asuntos de Personal Académico-Universidad Nacional Autónoma de México (DGAPA-UNAM; PAPIIT IN202616, IN203612).
Materials
| Chloroform | JT Baker | 9180-03 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Methanol | JT Baker | 9070-03 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Acetic Acid | JT Baker | 9507-05 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Hexanes | JT Baker | 9309-02 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Diethylether | Sigma | 32203 | Enzymatic assays |
| bidistilled water | ANY | NA | Enzymatic assays |
| Tris Base | Sigma | T-1503 | Enzymatic assays |
| HCl | Baker | 9535-02 | Enzymatic assays |
| NaCl | Baker | 3624-01 | Enzymatic assays |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | Enzymatic assays |
| LB broth | ANY | NA | Bacterial growth, 10g tryptone + 5g yeast extract + 10g NaCl per liter of bidistilled water |
| tryptone | Becton Dickinson and Company | 211705 | Bacterial growth |
| yeast extract | Becton Dickinson and Company | 212750 | Bacterial growth |
| TY broth | ANY | NA | Bacterial growth, 8g tryptone + 3g yeast extract + 66mg CaCl2 2 H20 per liter of bidistilled water |
| CaCl2 2 H2O | Baker | 1332-01 | Enzymatic assays |
| isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) | Invitrogen | 15529-019 | Bacterial growth |
| Diethanolamine | Sigma | D-8885 | Enzymatic assays |
| MnCl2 | Sigma | 221279 | Enzymatic assays |
| Phospholipase A2 snake venom | Sigma | P0790 | Enzymatic assays |
| Phospholipase C Clostridium perfingrens | Sigma | P7633 | Enzymatic assays |
| Bis-p-nitrophenyl phosphate | Sigma | 07422AH | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl stearate | Sigma | N3627 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl dodecanoate | Sigma | 61716 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl decanoate | Sigma | N0252 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl palmitate | Sigma | N2752 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl butyrate | Sigma | N9876 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl octanoate | Sigma | 21742 | Enzymatic assays |
| Acetic Acid, sodium salt [1-14C] | Perkin Elmer | NEC084 | Bacterial growth |
| dimethylsulfoxide (DMSO) | JT Baker | 9224-01 | Enzymatic assays |
| Aluminium HPTLC silica gel 60 plates. Silica gel HPTLC plates size 20 x 20 cm, 25 sheets. | Merck | 105547 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Spectrometer UV/VIS Lambda 35 | Perkin Elmer | NA | Enzymatic assays |
| Storm 820 Phosphorimager | Molecular Dynamics | NA | Photostimulable Luminescence scanner |
| Multipurpose Scintillation Counter | Beckman Coulter | NA | Radioactivity Quantification |
| French Pressure Cell | ThermoSpectronic | NA | Breakage of cells |
| chromatography paper 3MM Chr | Whatman | 3030917 | TLC analysis |
| Sinorhizobium meliloti 1021our | reference 34 | studied strain | |
| Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS Competent cells | Novagen | 69451 | protein expression strain |
| pET9a vector | Novagen | 69431 | protein expression vector |
| pET17b vector | Novagen | 69663 | protein expression vector |
| sterile polystyrene round-bottom tube (14 ml) Falcon | Becton Dickinson | 352057 | radiolabeling of bacterial cultures |
| polypropylene microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Eppendorf | 30125.15 | Enzymatic assays |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycerol | Sigma | D9135 | lipid standard |
| L-α-phosphatidylcholine, dipalmitoyl | Sigma | P6267 | lipid standard |
| DL-α-monopalmitin | Sigma | M1640 | lipid standard |
| palmitic acid | Sigma | P0500 | lipid standard |
Referenzen
- Nelson, D. L., Cox, M. M. . Lehninger, Principles of Biochemistry. , (2013).
- Jaeger, K. E., Eggert, T. Lipases for biotechnology. Curr. Opin. Biotechnol. 13 (4), 390-397 (2002).
- Dowhan, W., Bogdanov, M., Mileykovskaya, E. Functional roles of lipids in membranes. Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and Membranes. , 1-37 (2008).
- Dowhan, W. Molecular basis for membrane phospholipid diversity: why are there so many lipids?. Annu. Rev. Biochem. 66, 199-232 (1997).
- De Rudder, K. E. E., Thomas-Oates, J. E., Geiger, O. Rhizobium meliloti mutants deficient in phospholipid N-methyltransferase still contain phosphatidylcholine. J. Bacteriol. 179, 6921-6928 (1997).
- Geiger, O., Röhrs, V., Weissenmayer, B., Finan, T. M., Thomas-Oates, J. E. The regulator gene phoB mediates phosphate stress-controlled synthesis of the membrane lipid diacylglyceryl-N,N,N-trimethylhomoserine in Rhizobium (Sinorhizobium) meliloti. Mol. Microbiol. 32 (1), 63-73 (1999).
- Klug, R. M., Benning, C. Two enzymes of diacylglyceryl-O-4′-(N,N,N,-trimethyl)homoserine biosynthesis are encoded by btaA and btaB in the purple bacterium Rhodobacter sphaeroides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (10), 5910-5915 (2001).
- Zavaleta-Pastor, M., et al. Sinorhizobium meliloti phospholipase C required for lipid remodeling duringphosphorus limitation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (1), 302-307 (2010).
- Pech-Canul, A., et al. FadD is required for utilization of endogenous fatty acids released from membrane lipids. J. Bacteriol. 193 (22), 6295-6304 (2011).
- Banerji, S., Flieger, A. Patatin-like proteins: a new family of lipolytic enzymes present in bacteria?. Microbiology. 150 (Pt 3), 522-525 (2004).
- Sahonero-Canavesi, D. X., et al. Fatty acid-releasing activities in Sinorhizobium meliloti include unusual diacylglycerol lipase. Environ. Microbiol. 17 (9), 3391-3406 (2015).
- Fischer, M., Pleiss, J. The Lipase Engineering Database: a navigation and analysis tool for protein families. Nucl. Acid. Res. 31 (1), 319-321 (2003).
- Sigrist, C. J. A., et al. New and continuing developments at PROSITE. Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D344-D347 (2013).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).
- Untergasser, A., et al. Primer3 – new capabilities and interfaces. Nucl. Acids Res. 40 (15), e115 (2012).
- Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Dubendorff, J. W. Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Methods Enzymol. 185, 60-89 (1990).
- Miller, J. H. . Experiments in Molecular Genetics. , (1972).
- Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), e1610 (2009).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method for total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37 (8), 911-917 (1959).
- Molecular Dynamics. . Phosphorimager SI User´s Guide. , (1994).
- Dixon, M., Webb, E. . Enzymes: Third Edition. , (1979).
- Rudolph, A. E., et al. Expression, characterization, and mutagenesis of the Yersinia pestis murine toxin, a phospholipase D superfamily member. J. Biol. Chem. 274 (17), 11824-11831 (1999).
- Kato, S., Yoshimura, T., Hemmi, H., Moriyama, R. Biochemical analysis of a novel lipolytic enzyme YvdO from Bacillus subtilis. Biosci. Biotechnol. Biochem. 74 (4), 701-706 (2010).
- Peppelenbosch, M. P. Kinome profiling. Scientifica (Cairo). , (2012).
- Manafi, M., Kneifel, W., Bascomb, S. Fluorogenic and chromogenic substrates used in bacterial diagnostics. Microbiol. Rev. 55 (3), 335-348 (1991).
- Kuznetsova, E., et al. Enzyme genomics: Application of general enzymatic screens to discover new enzymes. FEMS Microbiol. Rev. 29 (2), 263-279 (2005).
- Scopes, R. K. . Protein Purification, Principles and Practice. , (2010).
- Geiger, O., Lopez-Lara, I. M., Sohlenkamp, C. Phosphatidylcholine biosynthesis and function in bacteria. Biochim. Biophys. Acta. 1831 (3), 503-513 (2013).
