Abstract
Deviazioni da livelli normali e modelli di fluidi vascolari gioco di taglio ruolo importante nella fisiologia vascolare e fisiopatologia inducendo adattivo così come i cambiamenti patologici nel fenotipo endoteliale e l'espressione genica. In particolare, gli effetti disadattivi di periodico, flusso unidirezionale shear stress indotto possono innescare una varietà di effetti sui diversi tipi di cellule vascolari, in particolare le cellule endoteliali. Mentre ormai cellule endoteliali da diverse origini anatomiche sono state coltivate e approfondita analisi delle loro risposte al taglio fluido sono stati ostacolati dalla relativa complessità dei modelli di taglio (ad esempio, camera di flusso piatto parallelo, cono e modello di flusso piatto). Anche se questi rappresentano tutti ottimi approcci, tali modelli sono tecnicamente complessi e soffrono di svantaggi, tra cui i tempi di configurazione relativamente lungo e complesso, superfici basse, i requisiti per pompe e pressurizzazione spesso necessitano di sigillanti e guarnizioni, creando sfide per Both mantenimento di sterilità e l'incapacità di eseguire più esperimenti. Tuttavia, se più elevati di throughput modelli di flusso e taglio erano disponibili, maggiori progressi sulle risposte di taglio endoteliali vascolari, la ricerca di taglio particolare periodico a livello molecolare, potrebbe essere più rapida avanzata. Qui, descriviamo la costruzione e l'uso di anelli di taglio: un romanzo, semplice da montare, e poco costoso modello di coltura tissutale con un relativamente grande superficie che permette facilmente di un elevato numero di repliche sperimentali in unidirezionali, taglio periodico studi di stress su cellule endoteliali.
Introduction
Fluid shear stress ha dimostrato di modulare i programmi genetici endoteliali 1-5 mediante l'attivazione di elementi cis-normativo 6, istone acetiltransferasi attività 7 e gli elementi di risposta allo stress di taglio (SSRE) 8. Sforzo di taglio influenze contributi endoteliali verso la coagulazione modulando fattore tissutale 9 e attivatore tissutale del plasminogeno (tPA) 10 espressione. Shear stress influenza anche il controllo dell'angiogenesi 11 e il rimodellamento nave regolando la sintesi PDGF-B e la reattività 8. Il endoteliale derivate mediatori vasoattivi adrenomedullin, endotelina-1, urotensina II e relaxina sono disciplinate anche da taglio 12. Trascrizione di produzione di ossido nitrico sintasi endoteliale e la produzione di ossido nitrico sono entrambi di taglio dipendono 10. Shear controlla anche endoteliale ICAM-1 13. shear stress indotto dal flusso può quindi powerfully influenzare una grande varietà di risposte endoteliali. È importante sottolineare che, pulsazioni vascolari ora appaiono anche a svolgere ruoli importanti nella fisiopatologia di entrambi invecchiamento vascolare normale e forme di demenza vascolare 14 e può anche contribuire ad altre malattie neurodegenerative, come la sclerosi multipla 15.
Tibiali e cellule endoteliali delle arterie sono intrinsecamente esposti a diversi modelli di flusso emodinamici in vivo, e molti fenotipi di cellule endoteliali diversi possono essere esposti 16. A seconda della grandezza e la periodicità di flusso, gli effetti sulle cellule endoteliali possono includere l'attivazione delle cellule infiammatorie e l'apoptosi, che possono riflettere i cambiamenti nei geni o proteine espressione 17,18. Studi sulla risposte delle cellule endoteliali a tranciare fenomeni pertanto restano complicate dalle difficoltà nella produzione di modelli in vitro che producono in modo adeguato tali modelli di taglio.
Molti experime diversoprotocolli ntale sono stati sviluppati per applicare fluido shear stress endoteliale monostrati di cellule. Uno dei sistemi più utilizzati è la camera di flusso a piatti paralleli, che crea flusso laminare uniforme all'interno della camera 19 - 21. Una pompa peristaltica è tipicamente collegato per creare flusso periodico, che può ricapitolare caratteristiche di flusso tipiche di molti luoghi in vivo 22. Un'altra comune set-up utilizza il modello 'cono e piatto', dove il fluido sollecitazione di taglio viene determinata dalla velocità di rotazione del cono 23. Entrambi i sistemi, e altre intese simili a loro, può essere noioso per impostare e richiedono componenti che possono essere relativamente costosi e inaccessibili a molti laboratori.
Un'altra importante limitazione di questi modelli attuali è il numero relativamente basso di studi ripetute che possono essere eseguite contemporaneamente, ciascuno con un'area superficiale relativamente bassa. Questo aumenta il tempo e co mplexity di tali approcci. Pertanto, un modello ideale che induce shear unidirezionale e periodica potrebbe essere quella in cui un elevato numero di repliche di studio può essere facilmente impostato, ciascuno con una relativamente grande superficie. Inoltre, i modelli di cui sopra richiedono una messa a punto abbastanza sofisticato, che può essere un costo proibitivo per molti utenti. Un modello che può produrre disturbi di taglio dei fluidi utilizzando materiali di laboratorio di base potrebbe avere diversi vantaggi.
Un metodo semplice e altamente economico dell'applicazione unidirezionale, giornali sollecitazione di taglio comporta il posizionamento dei piatti circolari in un agitatore orbitale 24. Questo protocollo è molto semplice e può essere scalata fino a raggiungere elevati numeri di studio replicano, ciascuno con una relativamente grande superficie, come necessario. Tuttavia, le cellule situato nel centro del piatto sono esposti a diversi schemi di flusso di celle lungo la periferia, cedendo misti risposte fenotipiche cellulari nello stesso piatto.
_content "> In questo rapporto attuale, si descrive la costruzione e l'utilizzo di 'anelli di taglio', il nostro modello per la creazione di unidirezionale e periodica sforzo di taglio. Il progetto per l'anello di taglio in modo efficace" misti "fenotipi di taglio indotta cellulari limiti limitando il flusso percorso all'interno di un piatto di coltura circolare alla periferia attraverso il posizionamento di un anello interno. la costruzione e il funzionamento dell'anello di taglio è semplice ed economico e può essere facilmente scalabile per soddisfare una vasta gamma di agitatori orbitali utilizzando ampiamente disponibili forniture di coltura tissutale. Questo modello può essere applicato in esperimenti di cellule endoteliali di fornire modelli di flusso unidirezionali e periodici ai livelli fisiologici e patofisiologici.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Costruzione di 150 mm di diametro Shear anelli (Figura 1)
NOTA: anelli di taglio possono essere costruiti per creare molteplici dimensioni variando le dimensioni della parabola Petri esterne ed interne, con conseguente dispositivi con diverse superfici totali, rese cellulari e sviluppato gamme di forze di taglio. Questo rapporto descrive un piatto 150 millimetri combinato con un interno piatto 100 mm per una superficie totale 98 cm 2 (Figura 2).
Figura assemblaggio ring 1. Shear. La parte superiore della figura mostra un anello di taglio parzialmente assemblato. Iniettare 0,5 ml di cloruro di metilene attraverso il foro 3 mm con una pipetta di trasferimento se una tenuta non è completamente formato tra i piatti interni ed esterni. L'anello di taglio è sigillata chiusa mediante l'applicazione di un cordone di 1 millimetro di spessore di adesivo di gomma di silicone intorno alla EDG internoe della parte superiore dell'anello di taglio. La porzione inferiore della figura mostra l'anello di taglio montato. Il blu rappresenta l'area delle cellule endoteliali placcato. Le frecce rosse esterne ed interne indicano il moto orbitale dell'anello di taglio e dei media all'interno dell'anello di taglio quando sono immessi su un agitatore orbitale. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. misure di superficie per un anello di taglio 150 mm (non in scala). Pannello superiore mostra lo spostamento centrifugo di liquido verso l'anello esterno in risposta alla rotazione orbitale. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
- Creare un modello di costruzione anello di taglio generando un150 millimetri profilo bordo esterno in software di presentazione con un diametro interno di 100 mm posto al centro del cerchio 150 mm. Stampa il modello su un foglio di carta bianca formato A4.
- Pipettare 10 ml di cloruro di metilene (diclorometano) in un 150 millimetri piatto di vetro Petri. E 'fondamentale che il piatto è di vetro e non in polistirolo (o altro materiale plastico vinile), il cloruro di metilene solubilizza maggior parte della plastica e viene qui utilizzato per unire componenti in plastica.
ATTENZIONE: Utilizzare guanti per tutte le costruzioni con adeguata ventilazione cappuccio. Il cloruro di metilene è un irritante contatto ed è epatotossici. - Allineare di 150 mm piatto di plastica Petri sul modello di anello di taglio esterno.
- Praticare un foro 3 mm al centro di un piatto 100 millimetri con un utensile rotante. Rimuovere eventuali trucioli di plastica prodotta dalla perforazione.
- Tenendo con una mano guantata, invertire e immergere il bordo superiore della piastra Petri 100 mm dal passaggio precedente nel pool di cloruro di metilene per circa 3 sec.
- Transfer il "bagnare" 100 millimetri piatto edge-down sul centro di un piatto 150 mm, facendo attenzione ad allineare il piatto 100 millimetri sul modello marcato. Il cloruro di metilene viene fondere la plastica, unendo i piatti da 100 mm e 150 mm. Ruotare delicatamente il piatto 100 millimetri in senso orario e antiorario alcune volte per assicurare una buona adesione al piatto 150 mm.
NOTA: Prestare la massima attenzione per garantire il corretto allineamento del piatto interno al centro del piatto esterno. allineamento eccentrico può provocare variazioni della tensione di taglio in diversi punti del anello di taglio. Fare attenzione a non permettere cloruro di metilene a gocciolare accidentalmente sulla porzione pista esterna del piatto 150 millimetri Petri durante il posizionamento del piatto a 100 mm. Ciò fondere la plastica sulla superficie inferiore in cui le cellule saranno crescita, creando una superficie irregolare che può causare disturbi di flusso. - Una volta che il cloruro di metilene è asciugato, capovolgere i piatti appena associato Petri sopra e controllare attentamente i punti di contatto per assicurare cheuna tenuta stagna è formata tra le due piastre di Petri.
- Se una tenuta non è completamente formato, iniettare 0,5 ml di cloruro di metilene attraverso il foro 3 mm con una pipetta. Sollevare il piatto e ruotare delicatamente per consentire al cloruro di metilene per raggiungere il bordo.
NOTA: Se ruotato troppo rapidamente, il cloruro di metilene può versare nella porzione esterna del piatto 150 mm, deformando la superficie in cui le cellule crescono e rovinando l'anello di taglio. Perdite anelli di taglio deve essere eliminata. - Sigillare il foro nel piatto 100 millimetri applicando un cordone 3 mm sigillante gomma siliconica.
- Utilizzando un utensile rotante dotato di una testa di taglio piatta, tagliare la parte top 3 cm di un tubo coltura tissutale polistirene 15 ml conica, lasciando almeno 1 cm del tubo sotto il tappo. Lucidatura del bordo del tubo tagliato fino liscia e piatta con la parte piatta della testa di taglio. Rimuovere eventuali trucioli di plastica prodotte dalla macinazione.
- Tracciare le tagliate tubo da 15 ml sulcoperchio del piatto 150 mm con un marcatore, circa 0,5 cm dal bordo del piatto. Eseguire un foro all'interno del cerchio disegnato, con un margine di circa 1-2 mm dal bordo del cerchio.
- Posizionare la parte superiore del tubo conico tagliato sopra il foro. Usando una pipetta, applicare circa 250 ml di cloruro di metilene ai bordi di taglio del tubo conico di impegnare il tubo conico al coperchio 150 mm.
- Sigillare il coperchio 150 millimetri sul piatto 150 millimetri applicando 1 mm di spessore perlina di sigillante gomma siliconica intorno al bordo interno della parte superiore piastra Petri.
2. Sterilizzazione dei Shear Anelli
- Pipettare circa 10 ml di soluzione salina tamponata di fosfato nel ring taglio di nuova formazione attraverso la porta di conica tubo da 15 ml. Turbinano intorno a rimuovere i detriti all'interno dell'anello di taglio. Rimuovere il tampone fosfato con un aspiratore pipetta / vuoto Pasteur.
- Ripetere il passaggio precedente fino a quando i detriti viene rimosso.
- per sterilize l'anello di taglio, utilizzare una combinazione di un risciacquo etanolo al 70% con irradiazione UV.
- Svitare il tappo sfiato, pipetta circa 10 ml di etanolo al 70% attraverso la porta di accesso, e avvitare il tappo. Ruotare e capovolgere sopra l'anello di taglio più volte, in modo che l'interno dell'anello di taglio è accuratamente lavato.
- Sotto una cappa aspirante, aspirare in eccesso il 70% di etanolo. Con un flacone spray, accuratamente spruzzare il foro del tappo e l'accesso con il 70% di etanolo.
- Posizionare l'anello di taglio e il tappo sotto radiazione UV all'interno della cappa di coltura di tessuti fino a completa asciugatura.
- Una volta asciutto, avvitare il tappo e memorizzare sterilizzato anelli di taglio a temperatura ambiente fino al momento in placcatura coltura cellulare.
3. Studi sforzo di taglio
- Piatto cellule endoteliali in anelli di taglio sterilizzati secondo il protocollo standard di coltura cellulare in genere utilizzando un rapporto 1: 4 di divisione per linee cellulari endoteliali trasformate.
NOTA: Ratto microV retinacellule endoteliali ascular stati ottenuti commercialmente. cellule endoteliali del cervello umano (hCMEC / D3), le cellule sono state fornite come un dono generoso da Dr. Pierre-Oliver Couraud (Inserm, Francia) sono state coltivate in terreno di base endoteliale completa (EBM). - Consentire culture per raggiungere confluenza prima di iniziare gli studi di flusso. Utilizzare 30 ml di terreni di coltura tissutale (10% di siero fetale bovino, media di Dulbecco modificato Eagle con 1% di penicillina / streptomicina / amfotericina). Cambiare mezzo di coltura cellulare ogni 3 giorni e mantenere le cellule a 37 ° C con 7,5% di CO 2 e 92,5% camera d'aria.
- Posizionare il agitatore orbitale nell'incubatrice.
Nota: Shaker orbitali sono tipicamente pesanti (> 10 kg). Posizionare il agitatore orbitale sul piano di fondo dell'incubatore per ridurre al minimo lo stress mensola e vibrazioni. - Posizionare gli anelli di taglio sperimentale sul agitatore orbitale. Posizionare gli anelli gruppo di controllo taglio statico all'interno dello stesso incubatore.
- Stimare la sollecitazione massima di taglio all'interno del shanello di orecchio con l'equazione
dove 
è il raggio di rotazione per l'agitatore orbitale (in cm), 
è la viscosità del mezzo (in poise), 
è la densità del fluido (in g / ml), e 
è la frequenza di rotazione (in rotazione / sec) 24. - Avviare l'impostazione di rotazione sul agitatore orbitale al numero di giri desiderato (ad esempio, 90 rpm), lasciando gli anelli di taglio sul shaker per la durata desiderata di applicazione sollecitazione di taglio (ad esempio, 72 hr).
NOTA: Shaker orbitali possono produrre calore, per cui la temperatura dell'incubatrice deve essere monitorata inizialmente per garantire 37 ° C viene mantenuta per tutta la durata dell'esperimento. Alternativamente, sanelli intendere possono essere trasferiti nelle camere ambientali (ad esempio, da camera incubatore modulare) e poi posto all'interno di un incubatore di rotazione. - Dopo strati di cellule sono stati esposti al taglio per il tempo desiderato, rimuovere gli anelli di taglio dal termostato. Estrarre il coperchio anello di taglio e recuperare cellule e / o supporti per l'esame finale desiderato analisi (ad esempio, Western blotting, fluorescenza attivato l'ordinamento delle cellule, ecc) 25.
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Representative Results
Qui vi presentiamo i risultati rappresentativi sia hCMEC / D3 cellule endoteliali del cervello e della retina di ratto monostrati di cellule endoteliali microvascolari, coltivate in anelli di taglio.
Dopo aver lasciato monostrati di cellule endoteliali cerebrali hCMEC / D3 a crescere a confluenza in completa EBM, gli anelli di taglio sono stati posti su un agitatore orbitale per 72 ore. Usando l'equazione dal punto 3.5, il massimo sforzo di taglio calcolato 
era circa 2,8 dyne / cm 2 (con parametri 
= 0,95 cm, 
= 0,0101 equilibrio, 
= 0,9973 g / ml 24, 
= 1.5 giri / secondo ). Abbiamo trovato che questi monostrati di cellule endoteliali talvolta presentano allineamento parallelo alla direzione del flusso periodico (figura 3), anche se questo non è uniformemente osservata perché strati cellulari solito hanno un'eccellente adesione alla superficie dell'anello di taglio durante lo studio.
Dopo aver lasciato la retina monostrati di cellule endoteliali microvascolari ratto a crescere fino a confluenza in media cellule di ratto endoteliali completo, tra cui EGF / VEGF integratori fattore di crescita, gli anelli di taglio sono stati posti su un agitatore orbitale per 72 ore. Usando l'equazione dal punto 3.5, il massimo sforzo di taglio calcolato era circa 12 dine / cm 2 (con i parametri = 0,95 cm, = 0,0101 equilibrio,iles / ftp_upload / 54632 / 54632eq4.jpg "/> = 0,9973 g / ml 24, = 4 giri / secondo). La Figura 4 mostra che, rispetto al controllo caricamento di β-actina, c'era una grande e significativa perdita di molecola di piastrine endoteliali adesione cellulare (PECAM-1 / CD31) dalla superficie delle cellule endoteliali.
PECAM-1 è una proteina integrale di membrana, che è un membro del immunoglobuline (Ig) -superfamily che contiene un immunoreceptor tirosina-dipendente motivo inibitorio o 'ITIM' 26. PECAM-1 non solo è espresso sulle cellule endoteliali, ma si trova anche sulle cellule ematopoietiche. PECAM-1 svolge un ruolo significativo nella adesione cellula-cellula endoteliale, leucociti giunzionale trasmigrazione, segnalazione cellulare, e, soprattutto, meccano-trasduzione di sforzo di taglio. Il ruolo di PECAM-1 nel rilevamento shear stress è critica per le funzioni di endotheli vascolare cellule di Al e omeostasi 17. Quando monostrati endoteliali sono esposti a sollecitazioni di taglio, PECAM-1 risponde direttamente alla forza meccanica esercitata su di esso dal alterarne la fosforilazione della tirosina, e la successiva attivazione del ERK1 / 2 cascata di segnalazione 27. Inoltre, il PECAM-1-eNOS complessa associazione è interrotta da disturbi nella sollecitazione di taglio 28. Pertanto, PECAM-1 permette alle cellule endoteliali vascolari per rilevare variazioni di forze di sollecitazione di taglio di fluido che può portare a dilatazione reattiva della parete del vaso 29.
Questi dati supportano questo modello che mostra che le cellule endoteliali rispondono a esposizione a periodica, taglio fluido unidirezionale da down-regolazione di un giunzionale importante e determinante l'adesivo, che media il contatto intercellulare, nonché lo scambio delle cellule transvascular.
632fig3.jpg "/>
Figura 3. Cervello morfologia delle cellule endoteliali in un anello di taglio. La comparsa di monostrati cellulari hCMEC / D3endothelial in anelli di taglio dopo 48 ore di taglio fluido periodica o l'esposizione statica. L'allineamento delle culture non è sempre osservato parallelamente alla direzione del flusso (indicato dalla freccia). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. risposte delle cellule a taglio periodico. Rat retina microvascolari monostrati di cellule endoteliali coltivate in anelli di taglio ha mostrato una riduzione PECAM1 / CD31 rispetto al beta-actina (n = 3 ciascuno, gli studenti non appaiati t-test, * p <0.05, barre di errore si riferiscono alla deviazione standard), a seguito di 72 ore di periodico di karitè fluidor in anelli di taglio.
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Discussion
La costruzione del sistema ad anello di taglio per esporre le cellule endoteliali al taglio è un approccio semplice per eseguire studi shear stress. Tuttavia, ci sono alcuni punti che sono fondamentali per l'ottenimento di anelli di taglio superiore e risultati migliori. Un sigillo completo dovrebbe essere fatta tra l'anello interno ed esterno per evitare che i supporti da perdite che potrebbe creare incoerente sforzo di taglio tra i campioni. Se una tenuta completa non è fatto, una quantità minima di cloruro di metilene deve essere aggiunto al bordo tra il piatto interno ed esterno con una pipetta di trasferimento attraverso il foro dell'anello interno. Delicatamente ruotando l'anello dovrebbe consentire il cloruro di metilene per formare una tenuta completa. Inoltre, i trucioli di plastica prodotte involontariamente da taglio possono essere presenti in pista ad anello di taglio, in modo da risciacquare l'anello di taglio dopo la costruzione dovrebbe rimuovere eventuali residui che potrebbero influenzare negativamente la crescita cellulare e dare incoerente applicazione sforzo di taglio.
i sanelli udite descritti nell'articolo sono relativamente grandi dimensioni, portando ad un elevato volume di uscita per campione. Tuttavia, le versioni più piccole potrebbero essere costruiti utilizzando piccole piastre Petri (ad esempio, 100mm Petri con un inserto 60 mm). Costruire più anelli di taglio più piccoli potrebbero consentire i numeri più alti degli studi replica, pur mantenendo relativamente grandi volumi di fluidi e superfici per campione rispetto ad altri metodi.
Alcuni problemi sono stati notati quando si usano anelli di taglio. Innanzitutto, alcuni agitatori orbitali producono quantità in eccesso di calore, e alcuni incubatori riescono a controllare questo aumento di temperatura. Ciò può essere evitato la selezione appropriata di rotatori e l'uso di incubatori manicotto termostatico non acquose, che si scambiano calore molto più facilmente. contaminazione cultura è un altro potenziale problema quando si utilizzano gli anelli di taglio, in particolare dopo il montaggio in un ambiente open-air. anelli di taglio devono essere accuratamente sterilizzati prima dell'uso.
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Disclosures
J. Winny Yun ha un assegno di ricerca della fondazione Annette Funicello. J. Steven Alexander ha il supporto di ricerca del Dipartimento di Neurologia, LSUHSC-S.
Acknowledgments
Gli autori vorrebbero riconoscere l'aiuto di Mr. Christopher Nguyen, Aaron Hunter e la Shreveport Jumpstart, SMART, e programmi di formazione Biostart così come il reparto Centenario College of Louisiana di Biofisica, Shreveport, LA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 x 20 mm plastic tissue culture dish | Corning | 430167 | The dishes must be polystyrene |
| 150 x 25 mm plastic tissue culture dish | Corning | 430599 | The dishes must be polystyrene |
| 150 mm glass Petri dish | Fisher | 3160150BO | |
| 15 ml polystyrene tissue culture plastic tubes | Falcon | 352099 | |
| Methylene chloride | Sigma-Aldrich | D65100 | |
| silicone rubber sealant | DAP | 7079808641 | |
| ethanol | Decon | 2701 | |
| 3 ml transfer pipette | Becton-Dickinson | 357524 | |
| printer paper | |||
| scissors | |||
| gloves | |||
| rotary tool and set | Dremel | 4000-6/50 | |
| rotary tool cutting head | Dremel | EZ476 | |
| rotary tool drill head | |||
| distilled water | |||
| orbital shaker | VWR | 57018-754 | |
| incubator | |||
| Rat retinal microvascular endothelial cells | Cell Biologics | RA-6065 |
References
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