Un metodo per l'RNA di misura<em> N</em⁶ -methyladenosine modifiche di cellule e tessuti

Summary

Un metodo di blotting nord modificato per misurare N ⁶ -methyladenosine (m ⁶ a) delle modifiche in RNA è descritto. L'attuale metodo in grado di rilevare le modifiche in diversi RNA e controlli sotto vari disegni sperimentali.

Abstract

N⁶-Methyladenosine (m⁶A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies have revealed that these reversible RNA modifications affect RNA splicing, translation, degradation, and localization. Multiple physiological processes, like circadian rhythms, stem cell pluripotency, fibrosis, triglyceride metabolism, and obesity are also controlled by m⁶A modifications. Immunoprecipitation/sequencing, mass spectrometry, and modified northern blotting are some of the methods commonly employed to measure m⁶A modifications. Herein, we present a northeastern blotting technique for measuring m⁶A modifications. The current protocol provides good size separation of RNA, better accommodation and standardization for various experimental designs, and clear delineation of m⁶A modifications in various sources of RNA. While m⁶A modifications are known to have a crucial impact on human physiology relating to circadian rhythms and obesity, their roles in other (patho)physiological states are unclear. Therefore, investigations on m⁶A modifications have immense possibility to provide key insights into molecular physiology.

Introduction

Dynamic and reversible RNA modifications have important roles in RNA homeostasis. Four decades ago, N⁶-methyladenosine (m⁶A) modifications were found to be abundant in eukaryotic transcriptomes¹. They have diverse functions in messenger RNA (mRNA), ribosomal RNA (rRNA), small nucleolar RNA, transfer RNA, and microRNA². The m⁶A modifications of mRNA influence their splicing³, translation⁴, degradation⁵, and localization². Moreover, they affect ribosome biogenesis and microRNA function⁶. The evolutionary conservation of m⁶A modifications of RNA is noted in unicellular bacteria to multi-cellular humans⁷. Delineation of the roles of m⁶A modifications is currently under extensive exploration. The efforts are expected to provide new insights into transcription control. Recent studies reveal that other chemical modifications of mRNA⁸ also play critical roles in RNA metabolism.

Circadian rhythms⁹, stem cell pluripotency¹⁰, triglyceride metabolism⁴, fibrosis¹¹, obesity¹², and major depression¹³ are a few examples of processes where m⁶A modifications are known to control outcomes. Many circadian clock gene transcripts have m⁶A sites¹⁴. Modulation of m⁶A methylase or demethylase elicits circadian period changes¹⁵. Mettl3, an m⁶A transferase, is a regulator for stem cell pluripotency. A deficiency of Mettl3 leads to early embryonic lethality and aberrant lineage priming at the post-implantation stage¹⁰. A deficiency of fat mass- and obesity-associated (FTO), an m⁶A demethylase, in adipocytes affects fatty acid mobilization and body weight through posttranscriptional regulation of Angptl4⁴. These studies reveal that m⁶A not only controls mRNA processing, but also plays critical roles in embryological development and patho-physiology. The function of m⁶A modifications holds implications for therapeutic considerations in the future.

Several methods are available to measure m⁶A modifications of RNA^16-18. Traditionally, thin layer chromatography (TLC) and high-performance liquid chromatography (HPLC) are used to study the distribution of m⁶A in several RNAs^19,20. Mass spectrometry is a sensitive tool for the detection of m⁶A modifications in RNA. However, the RNA needs to be excised by RNase into short fragments before analysis by mass spectrometry²¹. Methyl-RNA immunoprecipitation and sequencing (m⁶A-Seq)²² immunoprecipitates fragmented RNAs with m⁶A-specific antibodies and performs parallel RNA sequencing. This method generates transcriptome-wide m⁶A landscapes. High-resolution mapping of m⁶A individual-nucleotide-resolution cross-linking and immunoprecipitation (miCLIP) further maps m⁶A modifications at a single-nucleotide resolution²³. Both methods provide details of m⁶A modification across the whole transcriptome, with specific genes’ information. However, quantifications and standardization in both methods are difficult if experiments require the comparison of multiple conditions. Moreover, fragmentations of RNA for m⁶A-Seq alter the original RNA structure, which may affect native m⁶A levels. To detect global m⁶A modifications of RNA and their changes under different experimental conditions, we report a method that employs a modified northern blotting protocol. This method resolves RNA by molecular weight, using gel electrophoresis¹⁸. This procedure provides better standardization and quantifications for experiments that involve multiple conditions or samples. It also provides specific m⁶A modification information for different RNAs, whether rRNA, mRNA, or microRNA.

Protocol

NOTA: L'RNA totale m 6 A livello comprende rRNA, mRNA, e altri piccoli RNA. Dal momento che l'RNA ribosomiale è abbondante m 6 modifiche A, la misura di m 6 livelli A dovranno prendere in considerazione questo fatto. Isolamento 1. RNA Utilizzando la soluzione di decontaminazione ribonucleasi (spruzzato su tovaglioli di carta), pulire le pipette e le superfici banco di laboratorio. asciugamani di carta bagnati con acqua priva di nucleasi e pulire le pipette e le superfici banco di laboratorio di nuovo. RNA Estrazione Isolamento RNA totale Utilizzando un agitatore, mescolare 50-100 mg di tessuto o 5-10 x 10 6 cellule in 1 ml di soluzione di isolamento dell'RNA mantenuti a 4 ° C. NOTA: più tessuto (100-150 mg) può essere richiesto per i campioni di tessuto adiposo di topi a causa delle concentrazioni di RNA inferiori in esso. I campioni provengono da cuore del mouse, fegato, muscolo scheletrico, polmone, cervello e macrofagi sono stati impiegati in precedenza 4. Incubate omogenati di esempio per 5 min a temperatura ambiente. Aggiungere 100 ml di 1-bromo-3-cloropropano (BCP) per 1 ml di omogenato del campione. Agitare le provette con forza per 15 s e procedere per isolare l'RNA totale secondo le istruzioni 24 del produttore. Poliadenilato mRNA Purificazione da RNA totale isolato Purificare mRNA poliadenilato utilizzando kit o protocolli disponibili. Agitare accuratamente per risospendere ciascuna delle seguenti soluzioni: soluzione vincolante, oligo (dT) perle di polistirene, e soluzione di lavaggio 2x. Assicurarsi che il oligo (dT) perline calda a temperatura ambiente prima dell'uso. Trasferire 120 ml di soluzione di eluizione per la preparazione in un tubo e si riscalda a 70 ° C su una piastra riscaldante. Pipetta fino a 500 mg di RNA totale in una provetta. Con l'acqua priva di nucleasi, regolare il volume a 250 ml. Aggiungere 250 ml di soluzione vincolante 2x alla RNA totale cosìluzione e brevemente vortex per mescolare il contenuto. Aggiungere 15 ml di oligo (dt) perline e vortex accuratamente per mescolare. Incubare la miscela a 70 ° C per 3 min. Rimuovere il campione dal blocco di riscaldamento e lasciar riposare a temperatura ambiente per 10 min. Centrifugare a 15.000 xg per 2 min. Rimuovere con attenzione il surnatante, lasciando dietro di sé circa 50 ml. Aggiungere 500 ml di soluzione di lavaggio per risospendere il pellet pipettando. Pipettare la sospensione in un set di tubi filtro rotativo / collezione. Centrifugare a 15.000 xg per 2 min. Rimuovere la colonna dal tubo di raccolta e scartare il flow-through. Riportare la colonna a tubo di raccolta. Pipettare 500 ml di soluzione di lavaggio sul filtro rotativo. Centrifugare a 15.000 x g per 2 minuti. Trasferire il filtro rotativo in un tubo di raccolta fresca. Pipettare 50 ml di soluzione di eluizione riscaldataa 70 ° C sul centro del filtro rotativo. Incubare per 2-5 minuti a 70 ° C. Centrifugare a 15.000 xg per 1 min. Pipettare un ulteriore 50 ml di soluzione di eluizione riscaldata a 70 ° C sul centro del filtro rotativo. Ripetere il passo 1.2.2.1.18. Aggiungere 100 mg glicogeno / mL, 0,1 volumi di tampone di 3 M acetato di sodio (pH 5,2) e 2,5 volumi di etanolo assoluto. Precipitato durante la notte a -80 ° C. Centrifugare a 15.000 xg per 25 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante. Lavare il pellet con 1 ml di etanolo al 75%. Centrifugare a 15.000 xg per 15 min a 4 ° C. Rimuovere con attenzione l'etanolo. A secco in aria per 3-5 minuti. Aggiungere 10 ml di acqua priva di nucleasi per dissolvere il pellet. Conservare a -70 ° C. RNA qualificazione e quantificazione Utilizzando uno spettrofotometro, determinare la concentrazione di RNA da noting l'assorbanza a 260 nm e 280 nm. Il rapporto A 260 / A 280 dovrebbe essere 1,8-2,2. Controllare la qualità del campione di RNA utilizzando 0,8% gel elettroforesi 25. NOTA: L'RNA totale eucariotica intatto dovrebbe mostrare intense bande 28S e 18S rRNA. Il rapporto di 28S contro intensità banda 18S rRNA per una buona preparazione RNA è ~ 2. 2. elettroforesi su gel e di trasferimento NOTA: I protocolli di preparazione del buffer sono riportati nella tabella 1. Formaldeide Gel di Preparazione (1%) Risciacquare tutte le apparecchiature elettroforesi con dietilpirocarbonato acqua (DEPC). Sciogliere 2.5 g di agarosio in 215 mL di acqua DEPC completamente in un forno a microonde. Aggiungere 12,5 ml di 10x 3- (N-morfolino) propanosulfonico (MOPS) buffer e 22,5 ml di formaldeide al 37%. Versare il tutto nell'apparecchio elettroforesi con un pettine 1,5 mm di spessore. Eliminare le bolle o spingere torlo per i bordi del gel con un pettine pulito. Lasciare il gel solidificare a temperatura ambiente. Preparazione del campione Mescolare 1-10 mg di RNA totale e 11,3 ml di tampone campione. Mescolare 2 ug del marcatore RNA (1 mg / mL) con 11.3 ml di tampone campione. Aggiungere acqua priva di nucleasi ai campioni da 2.2.1 e 2.2.2 ad un volume totale di 16 microlitri. Riscaldare a 60 ° C per 5 minuti, e poi raffreddare su ghiaccio. Mescolare 16 microlitri del campione da 2.2.3 con 4 ml di colorante inseguimento, che contiene 0,1 mg / mL di bromuro di etidio in ghiaccio. ATTENZIONE: il bromuro di etidio è forse teratogeno e tossico se inalato. Leggi bromuro di etidio scheda di sicurezza. elettroforesi Aggiungere 200 ml di 10x tampone MOPS a 1.800 ml di DDH 2 O per fare un tampone di corsa 1x MOPS. Utilizzare il tampone di corsa 1x MOPS per sciacquare i pozzetti del gel. Pre-run tegli gel a 20 V per 5 min. Caricare i campioni di RNA nei pozzetti del gel. Coprire con un foglio per evitare l'esposizione alla luce. Eseguire a 35 V per circa 17 ore (durante la notte) Esaminare e fotografare il gel sotto una luce UV. Trasferimento Tagliare il gel per rimuovere la parte non utilizzata. Preparare 500 ml di 10x tampone SSC (250 mL di 20x tampone SSC e 250 mL di acqua DEPC). Lavare il gel due volte con 10x tampone SSC per 20 minuti con agitazione a 50 giri al minuto. Tagliare 1 filtro foglio di carta grande abbastanza per servire come una carta stoppino, che assorbe buffer di trasferimento dalla sezione Trasferimento (Figura 1). Tagliare 4 pezzi di carta da filtro per la stessa dimensione del gel. Tagliare 1 foglio di membrana di nylon caricata positivamente alla stessa dimensione come il gel. Tracciare una tacca sul gel e la membrana come marcatore per assicurare il corretto orientamento. Immergere la membrana in tampone SSC 2x per 15 min. Versare 500 ml of 10x SSC tampone nel cassetto di trasferimento. Disporre il grande foglio di carta filtrante attraverso la piastra di vetro e bagnare la carta da filtro con il tampone di trasferimento. Stendete le bolle con una pipetta. Immergere 2 pezzi di carta da filtro pre-tagliati in buffer di trasferimento e metterli al centro della carta da filtro dal punto 2.4.5. Rimuovere eventuali bolle. Posare il gel superiore rivolto verso il basso sulla carta da filtro. Disporre la membrana sulla superficie del gel. Allineare le tacche del gel e la membrana. Mettere 2 pezzi di carta filtro pre-taglio sulla parte superiore della membrana e bagnare la carta da filtro con il tampone di trasferimento. Rimuovere eventuali bolle tra gli strati. Applicare pellicola intorno al gel di garantire che gli asciugamani assorbono solo fino tampone passa attraverso il gel e la membrana. Stack i tovaglioli di carta sulla parte superiore della carta da filtro. Inserire un lastra di vetro di grandi dimensioni sulla parte superiore degli asciugamani. Collocare un peso in cima alla pila. Mantenere notte per consentire l'RNA di trasferire dal gel alla membrana. 3. Rilevamento di N 6 -methyladenosine membrana reticolazione Mantenere la membrana umida nel tampone 2x SSC. Mettere 2 fogli di carta da filtro immersa con 10x SSC tampone in reticolante UV. Posizionare la membrana sulla parte superiore della carta da filtro, con il lato di RNA-adsorbito rivolto verso l'alto. Selezionare "modalità autocrosslink" (120.000 μJ) e premere il pulsante "Start" per avviare l'irradiazione. Esaminate la membrana ed il gel con UV immagine Gel collettore per confermare il trasferimento RNA dal gel alla membrana. immunoblotting Bloccare la membrana in latte scremato 5% in soluzione salina tamponata con Tris con Tween 20 (TBST) tampone a temperatura ambiente per 1 ora. Lavare tre volte con tampone TBST per 15 min. Incubare la membrana durante la notte in m 6 A (<em> soluzione N 6 -methyladenosine) anticorpo (1: 1.000 in 5% senza grassi del latte tampone TBST) a 4 ° C. Lavare la membrana tre volte con tampone TBST per 15 min. Incubare la membrana nella soluzione HRP-coniugato asino anti-coniglio anticorpo (1: 2.000 in tampone latte TBST 5% non grassa) per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare la membrana tre volte con tampone TBST per 15 min. Applicare il substrato chemiluminescente potenziato (0,125 ml per cm 2 di membrana). Cattura il chemiluminescenza con le impostazioni ottimali del imager digitale, secondo le istruzioni del produttore 26. m 6 una quantificazione Misurare la relativa m 6 A intensità chemiluminescente utilizzando il software ImageJ. Sotto il menu del software ImageJ, selezionare l'opzione "File" per aprire il file pertinente. Selezionare lo strumento "Rettangolo" da ImageJ e disegnare una cornice intornoi segnali. Se RNA ribosomiale non è il focus degli esperimenti, evitare le 18S e 28S RNA ribosomiale m 6 fasce A per il calcolo. Fai clic su "Comando" e "1" per confermare la corsia selezionato. Premere il tasto "Comando" e "3" per mostrare la trama selezionata. Fare clic sullo strumento "Straight" e tracciare le linee per separare l'area segmentata. Fare clic sullo strumento "Bacchetta" per registrare le misurazioni. Esportare i dati. Normalizzare i livelli di m 6 A con la 18S RNA ribosomiale banda dalla colorazione bromuro di etidio.

Representative Results

Dopo 14 giorni nel normale fase circadiana luce-buio, i topi wild-type sono stati collocati in buio costante. Gli RNA dal fegato sono stati campionati ad intervalli di 4 ore e studiate con modificato blotting settentrionale. La metilazione di rRNA, mRNA, e piccoli RNA erano chiaramente rilevata (Figura 2). Il confronto tra differenti tempi circadiani (CT) può essere accuratamente calcolata con lo standard 18S rRNA. C'era robusta oscillazione circadiana di m 6 livelli A in rRNA, mRNA, e piccoli RNA. Per evitare l'interferenza offerto da rRNA, RNA poliadenilato possono essere purificate, come al punto 1.2.2. Dopo la purificazione, l'rRNA può essere sostanzialmente eliminato per consentire una migliore visualizzazione di altri RNA (Figura 3). <stron g> Figura 1: Montaggio della unità di trasferimento macchia. è indicata l'unità di trasferimento capillare per asciugare l'RNA alla membrana. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 2: il ritmo circadiano delle m 6 levels in C57BL / 6J. Questa figura mostra la m 6 A blot di RNA totale da fegati di topi wild-type sacrificato il primo giorno della fase dark-scuro dopo 14 giorni di una normale fase leggera-buio a 4 h intervalli. La quantificazione è stata effettuata utilizzando il m 6 A differenza di densità delle immagini tra 18S e 28S rRNA. La m 6 A abbondanza stato normalizzato alla banda 18S rRNA dal gel formaldeide in basso.et = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 3: I m 6 una macchie con o senza rRNA. Rappresentante m sono mostrati 6 una macchie del totale RNA e l'RNA poliadenilato dal fegato di topi wild-type. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. 1 10x tampone MOPS (pH 7,0, proteggere dalla luce) MOPS 41.85 g 0.2 M Acetato di sodio 4.1 g 0,05 M EDTA, Disodium Salt 3.7 g 0,01 M acqua DEPC Totale 1 L Mescolare a temperatura ambiente 2 20x tampone SSC (pH 7,0) Cloruro di sodio 175,3 g 3 M citrato trisodico 88.3 g 0.3 M acqua DEPC Totale 1 L </td> Mescolare a temperatura ambiente, poi in autoclave 3 Dye monitoraggio Buffer 10x MOPS 500 microlitri 1x Ficoll 400 0.75 g 15% bromofenolo blu 0.01 g 0,2% xilene cianolo 0.01 g 0,2% acqua DEPC Totale 5 mL Conservare a -20 ° C 4 acqua DEPC Diluire il rapporto a 1: 1.000 di DEPC in DDH 2 O Mescolare notte a temperatura ambiente, poi in autoclave 5 tampone campione (riparo dalla luce) Buffer 10x MOPS 200 microlitri 37% di formaldeide 270 microlitri formammide 660 microlitri Conservare a -20 ° C </tbody> Tabella 1: Tamponi e soluzioni.

Discussion

Modifications of RNA have important roles in cellular function and physiology. The current understanding of the regulation, function, and homeostasis of these modifications is still being explored and expanded⁸. Therefore, a precise and gold-standard method to evaluate the modifications of RNA is needed. The modified northern blotting method provides precise quantification of RNA modifications and clear delineation of the modifications in diverse RNAs. Although the method requires at least 3 days, it can be standardized and can be used in various experimental designs. Moreover, with different antibodies, it can detect different RNA modifications²⁷.

It is important to separate different RNAs when analyzing RNA modifications. Ribosomal RNA comprises a large portion of the total amount of RNA^28,29. The results from analyzing RNA modifications only in total RNA will represent mostly the changes of rRNA. Methylation and other such modifications of rRNA could potentially mask the changes in other RNAs. With the procedure of gel separation, the modifications of mRNA and other small RNAs can be more accurately analyzed.

Transcriptome-wide mapping with m⁶A immunoprecipitation and sequencing provides detailed insight into the modification of each type of RNA²². It provides information on the specific RNAs and a resolution of around 80-120 bp. Although m⁶A-Seq can compare the modifications between different experimental conditions, the selection of proper standards and controls for such experiments is difficult¹⁸. Immunoprecipitation is difficult to reproduce, often giving significant variations amongst repeats. Moreover, m⁶A-Seq requires the fragmentation of RNA samples before immunoprecipitation and sequencing³⁰. The fragmentation process could potentially induce undue influences on the original RNA modifications. If the experiment does not need the specific gene’s information but requires different conditions for comparison, the current method provides better visualization and control for diverse experimental setups.

Modification of RNA is an important step in regulating transcriptional control³¹. However, the homeostasis and the regulatory mechanisms of various RNA modifications under diverse physiological realms are still unclear. Using the present modified northern blotting method, different RNA modifications can be quantified and compared. Furthermore, the changes and regulations of RNA modifications can be investigated in greater detail. In the future, it could also be possible to combine the experimental data from both the classical northern blotting and the modified northern blotting protocols, providing greater insights into RNA biology.

The most important factor determining the success of the modified northern blotting protocol is the integrity of the RNA sample. RNAs with some amount of degradation may yield good classical northern blotting results, but this could potentially have significant impact on the modified northern blotting results. The modifications of RNA in different tissues or cell lines could also vary significantly. It is important to test the suitable RNA sample loads for different tissues before performing the final experiments.

As blotting procedures have been traditionally named after Dr. Southern and different geographical directions, we propose the name “northeastern” blotting for the current technique.

Materials

RNaseZap solution	Ambion	AM9782	Protocol 1.1
TRI Reagent solution	Ambion	AM9738	Protocol 1.2.1.1
1-Bromo-3-chloropropane (BCP)	Sigma	B9673	Protocol 1.2.1.3
Ethanol	JTbaker	8006	Protocol 1.2.1.3
Isopropanol	Sigma	I9516	Protocol 1.2.1.3
GenElute mRNA Miniprep Kit	Sigma	MRN70	Protocol 1.2.2.1
Glycogen	Ambion	AM9510	Protocol 1.2.2.2
Sodium acetate	Fluka	71183	Protocol 1.2.2.2
Nuclease-free water	Ambion	AM9930	Protocol 1.2.2.6
DEPC	Sigma	D5758	Protocol 2.1.1
Agarose	JT Baker	A426	Protocol 2.1.2
MOPS	Sigma	M1254	Protocol 2.1.3
37% formaldehyde Solution	Sigma	F8775	Protocol 2.1.3
EDTA, Disodium Salt	JT Baker	8993	Protocol 2.1.3 10X MOPS buffer
formamide	Sigma	F7503	Protocol 2.2.1
RNA Millennium Marker	Ambion	AM7150	Protocol 2.2.2
Ethidium Bromide	Amresco	X328	Protocol 2.2.5
Ficoll 400	GE Healthcare	17-0300-10	Protocol 2.2.5 tracking dye
Bromophenol blue	Sigma	114391	Protocol 2.2.5 tracking dye
Xylene Cyanol	Sigma	X4126	Protocol 2.2.5 tracking dye
Sodium chloride	JT Baker	3624	Protocol 2.4.2 20X SSC buffer
Trisodium citrate	Sigma	S1804	Protocol 2.4.2 20X SSC buffer
filter paper	GE Healthcare	RPN6101M	Protocol 2.4.4
GE Hybond-N+ membrane	GE Healthcare	RPN303B	Protocol 2.4.6
Stratalinker UV Crosslinker 2400	Stratagene	400075	Protocol 3.1.2
Gel Catcher 1500	ANT Technology	Gel Catcher 1500	Protocol 3.1.5
Anti-m6A (N6-methyladenosine)	Synaptic Systems	202003	Protocol 3.2.3
Amersham ECL Anti-Rabbit IgG, HRP-linkd whole Ab	GE Healthcare	NA934	Protocol 3.2.5
ChemiDoc MP System	BIO-RAD	1708280	Protocol 3.2.8