Neonatal stroke is a significant cause of early brain injury requiring a translational model with consistent focal injury patterns and high reproducibility in order to enable study. This study describes the detailed surgical procedure for creating a non-hemorrhagic, unilateral focal ischemia-reperfusion injury in full-term-equivalent rodents.
A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature and mature brain. Stroke occurs commonly in the perinatal period in humans, and transient ischemia-reperfusion is the most common form of stroke in neonates. The reperfusion phase is a critical component of injury progression, which occurs over a period of days to weeks, and of the endogenous response to injury. This postnatal day 10 (p10) rat model of transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) creates a unilateral, non-hemorrhagic focal ischemia-reperfusion injury that can be utilized to study the mechanisms of focal injury and repair in the full-term-equivalent brain. The injury pattern that is produced by tMCAO is consistent and highly reproducible and can be confirmed with MRI or histological analyses. The severity of injury can be manipulated through changes in occlusion time and other methods that will be discussed.
AVC au cours de la période néonatale est une cause importante de décès et d' invalidité, survenant dans moins de 1 à 2 300 naissances vivantes 1. Cela conduit au développement du système nerveux central modifié et augmentation de la morbidité à long terme, y compris augmentation de l'incidence de l'épilepsie, infirmité motrice cérébrale, un retard mental, et d'autres types de moteur ou d'un dysfonctionnement cognitif. Les effets à long terme de l'AVC précoce font des modèles animaux traductionnelles essentiels pour l'examen des mécanismes de blessures et de réparation dans cette population, y compris les stratégies pour protéger le cerveau lésé ou pour améliorer la réparation.
Différents modèles d'ischémie ont été utilisés pour étudier les lésions cérébrales chez les animaux adultes, et alors que la procédure Rice-Vannucci (modifié Levine) 2 est couramment utilisé pour étudier une lésion hypoxique-ischémique dans le cerveau en développement, l' ischémie-reperfusion focale est un mécanisme de blessure distinct causant des blessures focale, avec un noyau blessé et penumbra et intact tissu distant. Les Koizumi 3 et 4 Longa modèles ont été développés chez les rats adultes pour obtenir une occlusion de l' artère cérébrale moyenne transitoire par l'artère carotide commune (ACC) et de l' artère carotide externe (ECA), respectivement. Dans les deux modèles, la ligature permanente et cautérisation des branches de l'artère sont importantes pour minimiser les saignements et de rationaliser la procédure chirurgicale, ce qui provoque aussi des effets néfastes sur la capacité de l'animal à se nourrir et de prendre du poids après une blessure. En outre, il existe des mécanismes de blessures distinctes dans le cerveau immature et des modèles spécifiques de blessures observés en conséquence.
Plus récemment, la course photothrombotique (méthode Rose Bengale) 5 et ligature MCA permanente 6 ont été utilisées pour étudier la course néonatale et adulte. Les deux accidents vasculaires cérébraux photothrombotique et MCA ligature créer des changements permanents dans le flux sanguin cérébral qui se traduisent par un manque de reperfusion. Revascularisation est un élément essentiel du développement et de la progression des lésions focales, avec excitotoxicité accrue, formation de radicaux libres, et la production d'oxyde nitrique conduisant à la mort cellulaire retardée qui implique des cascades de signalisation qui sont distincts de la phase ischémique 7. Hypoxie-ischémie implique la ligature de la carotide unilatérale permanente suivie par une hypoxie globale, qui diffère aussi de la cause de la lésion hypoxique-ischémique chez l'homme et ne provoque pas un modèle de lésion focale constante, ce qui rend l'étude du noyau blessé et penumbra plus difficile.
Nous avons décrit précédemment un modèle d'ischémie-reperfusion accident vasculaire cérébral non hémorragique chez le rat immature utilisant une occlusion de l' artère cérébrale moyenne transitoire (MCAO) 8, 9, 10. Cette méthode est moins invasive qui accède et obture la MCA à travers l'artère carotide interne sans ligati permanentou cautérisation. Cela fournit un modèle de blessure similaire à la cause la plus fréquente d'accident vasculaire cérébral pendant la période périnatale 11, 12. Ce modèle d'ischémie-reperfusion des résultats de blessures des dommages au striatum ipsilatéral et le cortex pariéto-temporale. Ce modèle de tMCAO permet également le contrôle de la gravité des blessures en faisant varier la durée de l'occlusion. L'examen des voies de signalisation et les changements histologiques dans le noyau et blessé et penumbra dans le tissu non endommagé ipsilatéral et controlatéral peut encore élucider les mécanismes de blessures et de réparation dans le cerveau immature. Cette étude démontrera ce modèle de blessure important pour le développement du cerveau.
Les étapes critiques au sein du protocole
Tout d' abord, il est important de maintenir la normothermie de l'initiation de l' anesthésie jusqu'à la guérison complète, car il y a des effets connus de l' hypothermie à la fois 17 et 18 hyperthermie sur la progression des lésions cérébrales chez les animaux immatures et matures. En second lieu, tout en assurant l'animal et de rétracter l'incision, un positionnement optimal pour surveiller la respiration et de veiller à ce que la trachée est libre de compression est essentiel. En troisième lieu, éviter de serrer ou d'étirement du nerf vague, car cela pourrait provoquer des changements dans la fréquence cardiaque avec la stimulation vagale. En quatrième lieu, parce que la rétraction de l'ICA est nécessaire pour contrôler le saignement pendant la artériotomie, il faut faire attention au degré de tension lors de la rétraction pour éviter d'endommager l'artère. Si l'artère ne se déchire de rétraction, ou s'il y a une mauvaise incision artériotomie, l'animal doit être exclu de l'analyse en raison du risqued'hémorragie et reperfusion pauvres.
Modifications et dépannage
Grâce à l'IRM comme guide, la longueur de suture peut être optimisée pour faire en sorte que la pointe de silicone obture correctement la MCA pour créer l'ischémie focale. Si l'IRM ne sont pas disponibles, les chiots peuvent être euthanasiés avant pour la dissection reperfusion pour visualiser la mise en place de la suture. Ajuster la longueur de suture au besoin. Le poids des petits est fortement corrélé avec les exigences de longueur de suture occlusive. Le temps d'occlusion peut être modifiée pour ajuster le degré de gravité des blessures.
En outre, la forme et la longueur de suture sont critiques. Pour P10 rats Sprague-Dawley et Long Evans pesant 19-21 g, 10 mm est la longueur optimale d'insertion dans notre expérience. En outre l'insertion de la suture occlusive peut provoquer une perforation de la MCA. De plus, la cohérence dans la forme du filament occlusive dans chaque opération se traduira par une plus grande cohérence des blessures pattern 19, 20. Pour cette raison, nous vous recommandons d'utiliser des sutures professionnellement fabriqués spécialement à cet effet. Il est également important de noter que le type de blessure peut varier entre les praticiens en raison des différences apparemment minute dans la technique.
Limites de la technique
L'exécution de cette technique dans un petit développement rongeurs nécessite une expérience significative. Si elle est effectuée correctement, le chirurgien est en mesure de provoquer un type de blessure très cohérente à travers les animaux de différentes tailles et d'atteindre un taux de survie supérieur à 95%. En outre, des outils chirurgicaux appropriés sont essentiels. Les instruments chirurgicaux doivent être bien entretenus pour assurer que tous les conseils de l'instrument se rapproche correctement.
Signification de cette technique par rapport aux méthodes existantes ou alternatives
Bien que l' hypoxie-ischémie, ou le modèle Rice-Vannucci 2 </sup>, est le plus souvent utilisé pour étudier une lésion hypoxique-ischémique dans le cerveau en développement, il est important de noter que ce modèle de tMCAO est distinct de HI en ce qu'il est l'ischémie focale transitoire sans hypoxie globale, suivie d'une phase de reperfusion lorsque la obstruction est enlevé et la circulation sanguine est rétablie. Cela provoque une blessure plus cohérente et reproductible et est plus clinique translationnelle en provoquant un type de blessure similaire à celle observée en plein terme AVC néonatal. Cela permet à l'étude des modèles de blessures focales et des réponses compensatoires dans le tissu non endommagé.
Les applications futures après la maîtrise de cette technique
Ce modèle est similaire à la cause la plus fréquente d'AVC chez les nouveau – nés humains, un thrombus occlusif transitoire qui se produit au cours de la période périnatale 11, 21. L'étiologie est pas tout à fait claire et est très probablement multifactorielle, mais il est présumé dans la plupart des cas to résulter d'emboles qui passent du placenta 11. En outre, de nombreux nouveau – nés ayant subi un AVC périnatal présumé présentent souvent une activité plus tard de saisie ou subtile examen neurologique focal Anomalies 22. Cela rend l'utilisation d'une approche cohérente, modèle de lésion de la traduction pour identifier les mécanismes de progression des blessures et des stratégies thérapeutiques possibles cruciales.
The authors have nothing to disclose.
Funding was provided by the NIH K08 NS064094 and UCSF REAC grants. The authors would like to acknowledge Nikita Derguin, Zinalda Vexler, and Joel Faustino for their assistance in the development of this technique.
Isoflourane | Henry Schein | 50033 | anesthetic, at 3% |
Trinocular Surgioscope | World Precision Instruments | PSMT5N | |
Heating pad | Sunbeam | 000731-500-000 | low to medium setting |
IR Thermometer | Extech Instruments | 72-5270 | |
Retraction kit for small animals | Fine Science Tools | 18200-20 | |
CermaCut Scissors | Fine Science Tools | 14958-09 | |
Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 112522-00 | 2x |
Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | 2x |
B-2 Micro Clamp | Fine Science Tools | 00398-02 | |
Forcepts for Clamp Application | Fine Science Tools | 00072-14 | |
Micro Vannas Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | 2mm cutting edge |
Occlusion Sutures | Doccol | 602123PK10 | 701712PK5Re |
Ruler | Fine Science Tools | ||
Hemostatic Agent | Avitene | DVL1010590 | |
6-0 Perma-Hand Silk Reverse CuttingSuture | Ethicon | 769G | |
Euthasol | Virbac | 710101 | 0.22 ml/kg |
Cotton Tipped Applicators | Henry Schein | 100-9249 | |
Laboratory Tape | VWR | 89097-990 |