كفاءة والخاصة بالموقع الأجسام المضادة وصفها من قبل Cycloaddition-أزيد آلكاين-روجت سلالة
Summary
Here, we present a protocol to site-specifically introduce chemical probes into an antibody fragment by genetically incorporating an azide-containing amino acid, and subsequently coupling the azide with a chemical probe by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC).
Abstract
هناك حاليا الكثير من الأدوات الكيميائية المتاحة لتقديم تحقيقات الكيميائية إلى بروتينات لدراسة بنيتها ووظيفتها. وهناك طريقة مفيدة هو بروتين الاقتران عن طريق إدخال وراثيا من الأحماض الأمينية غير طبيعي يحتوي على مجموعة وظيفية bioorthogonal. ويصف هذا التقرير بروتوكول مفصلة لجسم تصريف للموقع المحدد. ويتضمن البروتوكول تفاصيل التجريبية لدمج الجيني للحمض الأميني التي تحتوي على أزيد، ورد فعل الاقتران قبل cycloaddition-أزيد آلكاين-روجت سلالة (SPAAC). هذا رد فعل روجت سلالة العائدات عن طريق خلط بسيط من جزيئات التفاعل في درجة الحموضة الفسيولوجية ودرجة الحرارة، و لا يتطلب الكواشف إضافية مثل النحاس (I) أيونات وبروابط-مخلبية النحاس. ولذلك، فإن هذا الأسلوب سيكون مفيدا للاقتران البروتين العام وتطوير تقارن المخدرات الأجسام المضادة (ADCS).
Introduction
منذ الابلاغ عن التأسيس الجيني لل-methoxyphenylalanine ص في القولونية، وأدرجت 1 أكثر من 100 الأحماض الأمينية غير طبيعية (UAAs) بنجاح في البروتينات المختلفة. 1-3 ومن بين هذه UAAs، والأحماض الأمينية التي تحتوي على المجموعات الوظيفية bioorthogonal وقد درس على نطاق واسع وتمثل النسبة الأكبر. وتشمل المجموعات الوظيفية bioorthogonal المستخدمة في UAAs كيتون، 4 أزيد، 5 آلكاين، 6 cyclooctyne، 7 tetrazine، 8 α، β-أميد غير المشبعة، 9 norbonene، 10 transcyclooctene و 11 و bicyclo [6.1.0] -nonyne. 11 على الرغم من كل مجموعة وظيفية مزاياه وعيوبه، وقد استخدمت في الأحماض الأمينية التي تحتوي على أزيد أكثر على نطاق واسع لتصريف البروتين. ص -Azidophenylalanine (AF)، واحد من الأحماض الأمينية التي تحتوي على azido وغير متوفرة بسهولة، وeffic تأسيسهاiency ممتازة. بروتينات متحولة تحتوي على هذه الأحماض الأمينية يمكن أن يكون رد فعل مع أمكانيات التي كتبها cycloaddition المحفز النحاس أو مع cyclooctynes التي كتبها SPAAC. 12-20
في الآونة الأخيرة، المستحضرات الصيدلانية البيولوجية قد تجتذب اهتماما كبيرا في مجال الصناعات الدوائية. والمترافقة الأجسام المضادة المخدرات (ADC) هو فئة من الأجسام المضادة العلاجية التي هي مفيدة نظرا لقدرتها على العلاج الموجه لعلاج السرطانات البشرية 21 و أمراض أخرى. أكثر من 50 ADCS حاليا في التجارب السريرية، وعدد يتزايد بسرعة. في تطور ADCS، تحتاج إلى النظر فيها لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة وتقليل الآثار الجانبية العديد من العوامل. ومن بين هذه العوامل، وهي فعالة وخاصة بالموقع رد فعل الاقتران لتشكيل الرابطة التساهمية بين الأجسام المضادة والمخدرات أمر بالغ الأهمية. كفاءة المطلوبة والدقة في رد فعل الاقتران يمكن أن يتحقق عن طريق الاقتران مع مجموعة وظيفية bioorthogonal فيالأحماض الأمينية غير طبيعي أن يتم تضمينها على وجه التحديد إلى الضد. 22-26 هنا، ونحن التقرير بروتوكول لموقع على وجه التحديد دمج AF إلى جزء الأجسام المضادة وتصريف جزء الأجسام المضادة متحولة مع التحقيق الذي تجريه والكيمياء الحيوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
إدراج الجيني للالأحماض الأمينية غير طبيعية في البروتينات ديها العديد من المزايا مقارنة مع الطرق الأخرى المستخدمة لتعديل البروتين. 1-3 احدة من المزايا الهامة هو تطبيق العام لأي نوع من البروتين. من حيث المبدأ، لا يوجد أي قيود في اختيار البروتين المستهدف والموقع ا…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Materials
| 1. plasmid Construction | |||
| plasmid pBAD_HerFab_L177TAG | optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015) | ||
| plasmid pEvol-AFRS | Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) | ||
| DH10B | Invitrogen | C6400-03 | Expression Host |
| Plasmid Mini-prep kit | Nucleogen | 5112 | 200/pack |
| Agarose | Intron biotechnology | 32034 | 500g |
| Ethidium bromide | Alfa Aesar | L07482 | 1g |
| LB Broth | BD Difco | 244620 | 500g |
| 2. Culture preparation | |||
| 2.1) Electroporation | |||
| Micro pulser | BIO-RAD | 165-2100 | |
| Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2089 | 0.1cm electrode gap, pkg. of 50 |
| Ampicillin Sodium | Wako | 018-10372 | 25g |
| Chloramphenicol | Alfa Aesar | B20841 | 25g |
| Agar | SAMCHUN | 214230 | 500g |
| SOC medium | Sigma | S1797 | 100ML |
| 3. Expression and purification of HerFab-L177AF | |||
| 3.1 Expression of Herfab-L177AF | |||
| p-azido-L-phenylalanine (AF) | Bachem | F-3075.0001 | 1g |
| L(+)-Arabinose, 99% | Acros | 104981000 | 100g |
| Hydrochloric acid, 35~37% | SAMCHUN | H0256 | 500ml |
| 3.2 Cell lysis | |||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% | SAMCHUN | T1351 | 500g |
| EDTA disodium salt dihydrate, 99.5% | SAMCHUN | E0064 | 1kg |
| Sucrose | Sigma | S9378 | 500g |
| Lysozyme | Siyaku | 126-0671 | 1g |
| 3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography | |||
| Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | 25ml |
| Polypropylene column | QIAGEN | 34924 | 50/pack, 1ml capacity |
| Imidazole, 99% | SAMCHUN | I0578 | 1kg |
| Sodium phosphate monobasic, 98% | SAMCHUN | S0919 | 1kg |
| Sodium Chloride, 99% | SAMCHUN | S2907 | 1kg |
| 4. Conjugation of Purified HerFab-L177AF with Alkyne Probes Using Strain-Promoted Azide-Alkyne Cycloaddition (SPAAC) | |||
| Cy5.5-ADIBO | FutureChem | FC-6119 | 1mg |
| 5. Purification of Labeled HerFab | |||
| Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters | MILLIPORE | UFC500396 | 96/pack, 500ul capacity |
| 6. SDS-PAGE Analysis of Labeled HerFab and Fluorescent Gel Scanning | |||
| 1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 % | Sigma | 10708984001 | 10g |
| NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X | Thermofisher | NP0007 | 10ml |
| MES running buffer | Thermofisher | NP0002 | 500ml |
| Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels | Thermofisher | NO0321 | 12well |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Wako | 031-17922 | 25g |
| Typhoon 9210 variable mode imager | Amersham Biosciences |
Referenzen
- Wang, L., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Angew. Chem. Int. Ed. 44 (1), 34-66 (2004).
- Wu, X., Schultz, P. G. Synthesis at the interface of chemistry and biology. J. Am. Chem. Soc. 131 (35), 12497-12515 (2009).
- Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu. Rev. Biochem. 79, 413-444 (2010).
- Wang, L., Zhang, Z., Brock, A., Schultz, P. G. Addition of the keto functional groupto the genetic code of Escherichia coli. proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (1), 56-61 (2003).
- Chin, J. W., et al. Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. J. Am. Chem. Soc. 124 (31), 9026-9027 (2002).
- Deiters, A., Schultz, P. G. In vivo incorporation of an alkyne into proteins in Esshcerichia coli. Bioorg. Med. Chem. Lett. 15 (5), 1521-1524 (2005).
- Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (17), 3878-3881 (2011).
- Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with transcyclooctenes. J. Am. Chem. Soc. 134 (6), 2898-2901 (2014).
- Lee, Y. -. J., et al. A genetically encoded acrylamide fuctionality. ACS Chem. Biol. 8 (8), 1664-1670 (2013).
- Lang, K., et al. Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal raction. Nat Chem. 4 (4), 298-304 (2012).
- Lang, K., et al. Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. J. Am. Chem. Soc. 134 (25), 10317-10320 (2012).
- Jewett, J. C., Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Rapid Cu-free click chemistry with readily synthesized biarylazacyclooctynones. J. Am. Chem. Soc. 132 (11), 3688-3690 (2010).
- Debets, M. F., et al. Azadibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3 + 2) cycloaddition. Chem. Commun. 46 (1), 97-99 (2010).
- Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. From mechanism to mouse: a tale of two bioorthogonal reactions. Acc. Chem. Res. 44 (9), 666-676 (2011).
- Debets, M. F., et al. Bioconjugation with strained alkenes and alkynes. Acc. Chem. Res. 44 (9), 805-815 (2011).
- Mbua, N. E., Guo, J., Wolfert, M. A., Steet, R., Boons, G. -. J. Strain-promoted alkyne−azide cycloadditions (SPAAC) reveal new features of glycoconjugate biosynthesis. ChemBioChem. 12 (12), 1912-1921 (2011).
- Kuzmin, A., Poloukhtine, A., Wolfert, M. A., Popik, V. V. Surface functionalization using catalyst-free azide-alkyne cycloaddition. Bioconjug. Chem. 21 (11), 2076-2085 (2011).
- Yao, J. Z., et al. Fluorophore targeting to cellular proteins via enzymemediated azide ligation and strain-promoted cycloaddition. J. Am. Chem. Soc. 134 (8), 3720-3728 (2012).
- Hao, Z., Hong, S., Chen, X., Chen, P. R. Introducing bioorthogonal functionalities into proteins in living cells. Acc. Chem. Res. 44 (9), 742-751 (2011).
- Reddington, S. C., Tippmann, E. M., Jones, D. D. Residue choice defines efficiency and influence of bioorthogonal protein modification via genetically encoded strain promoted Click chemistry. Chem. Commun. 48 (9), 8419-8421 (2012).
- Chari, R. V. J., Miller, M. L., Widdison, W. C. Antibody-drug conjugates: an emerging concept in cancer therapy. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (15), 3751-4005 (2014).
- Tsao, M., Tian, F., Schultz, P. G. Selective staudinger modification of proteins containing p-Azidophenylalanine. ChemBioChem. 6 (12), 2147-2149 (2005).
- Brustad, E. M., Lemke, E. A., Schultz, P. G., Deniz, A. A. A general and efficient method for the site-specific dual-labeling of proteins for single molecule fluorescence resonance energy transfer. J. Am. Chem. Soc. 130 (52), 17664-17665 (2008).
- Milles, S., et al. Click strategies for single-molecule protein fluorescence. J. Am. Chem. Soc. 134 (11), 5187-5195 (2012).
- Jang, S., Sachin, K., Lee, h. J., Kim, D. W., Lee, h. S. Development of a simple method for protein conjugation by copper-free click reaction and its application to antibody-free Western blot analysis. Bioconjug. Chem. 23 (11), 2256-2261 (2012).
- Kazane, S. A., et al. Self-assembled antibody multimers through peptide nucleic acid conjugation. J. Am. Chem. Soc. 135 (1), 340-346 (2012).
- Ko, W., et al. Efficient and site-specific antibody labeling by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition. Bull. Korean Chem. Soc. 36 (9), 2352-2354 (2015).
- Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374 (2010).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Cho, H. S., et al. Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab. Nature. 421 (6924), 756-760 (2003).
- Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. Click chemistry : Diverse chemical function from a few good reactions. Angew. Chem. Int. Ed. 40 (11), 2004-2021 (2001).
