Mechanischer Stress kann die chondrogene Differenzierung von Stammzellen induzieren und bietet damit einen potentiellen therapeutischen Ansatz für die Reparatur von gestörtem Knorpel. Wir stellen ein Protokoll vor, um die chondrogene Differenzierung von aus Fett gewonnenen Stammzellen (ASCs) mit Hilfe der Zentrifugalgravitation (CG) zu induzieren. Die CG-induzierte Hochregulierung von SOX9 führt zur Entwicklung chondrogener Phänotypen.
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Methodenartikel
Chondrogene Differenzierung Induktion von Fettgewebe gewonnene Stammzellen durch Zentrifugalkraft Gravity
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Beeinträchtigter Knorpel kann nicht auf natürliche Weise heilen. Die derzeit fortschrittlichste Therapie für Knorpeldefekte ist die Transplantation von Chondrozyten, die mit Hilfe von Zytokinen aus Stammzellen differenziert werden. Leider ist die zytokininduzierte chondrogene Differenzierung kostspielig, zeitaufwändig und mit einem hohen Kontaminationsrisiko während der in vitro Differenzierung verbunden. Biomechanische Reize dienen aber auch als entscheidende Regulationsfaktoren für die Chondrogenese. Zum Beispiel kann mechanischer Stress die chondrogene Differenzierung von Stammzellen induzieren, was auf einen möglichen therapeutischen Ansatz zur Reparatur von beeinträchtigtem Knorpel hindeutet. In dieser Studie konnten wir zeigen, dass die Zentrifugalgravitation (CG, 2.400 × g), eine mechanische Belastung, die durch Zentrifugation leicht ausgeübt werden kann, die Hochregulierung der geschlechtsbestimmenden Region Y (SRY)-box 9 (SOX9) in aus Fettgewebe gewonnenen Stammzellen (ASCs) induziert, was dazu führt, dass sie chondrogene Phänotypen exprimieren. Die zentrifugierten ASCs exprimierten höhere Konzentrationen von chondrogenen Differenzierungsmarkern wie Aggrecan (ACAN), Kollagen Typ 2 alpha 1 (COL2A1) und Kollagen Typ 1 (COL1), aber niedrigere Spiegel von Kollagen Typ 10 (COL10), einem Marker für hypertrophe Chondrozyten. Darüber hinaus wurde die chondrogene Aggregatbildung, eine Voraussetzung für die Chondrogenese, in zentrifugierten ASCs beobachtet.
Einleitung
Defekte im Gelenkknorpel nicht heilen natürlich. Folglich Stammzelltransplantation hat sich als vielversprechender Ansatz für die Reparatur von Knorpel beeinträchtigt vorgeschlagen worden. Jedoch erfordert dieses Verfahren sowohl die Übernahme von einer ausreichenden Anzahl von Stammzellen und die Induktion dieser Zellen chondrogene Differenzierung zu unterziehen. Knochenmark (BM) wurde als Quelle für Stammzellen weit verbreitet, aber Zellisolation aus BM hat zwei wesentliche Nachteile: Invasivität und ungenügender Ausbeute. Aufgrund seiner Leichtigkeit des Erwerbs, Fettgewebe ist eine bevorzugte Quelle für Stammzellen. Frühere Studien zeigten die Machbarkeit Stammze....
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Protokoll
Das Studienprotokoll wurde von der Ethikkommission der Katholischen Universität von Korea (KC16EAME0162) und führte nach NIH-Richtlinien zugelassen. Alle Gewebe wurden mit schriftliche Einverständniserklärung erhalten.
1. Kreisel Gravity Laden und Pelletkultur
- Zellkultur und Ernte
- Kultur ASCS (P2-P3, siehe Materialliste) in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium-Low Glucose (DMEM-LG), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin (P / S) bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2.
- Wenn die Zellen 80% Konfluenz erreichen, entsorgen Sie das Medium und die Zellen ....
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Ergebnisse
Kreiselschwerkraft induziert die Überexpression von chondrogenen Differenzierungsmarker in Fettgewebe gewonnenen Stammzellen.
Um das Ausmaß der Zentrifugal-Schwerkraft bestimmen, die geeignet ist die chondrogene Differenzierung zu induzieren, ASCs wurden mit unterschiedlichen Graden der CG stimuliert (0, 300, 600, 1.200 und 2.400 xg) für 15 min. Nach der Stimulation wurden die ASCs erneut ausgesät auf Kulturplatten und kultivi.......
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Diskussion
Die stemness Zustand von Zellen ist sehr wichtig für CG-induzierten Überexpression von SOX9. In unserer Studie konnte SOX9 Expression von CG in frühen Passage ASCs (2-3), aber nicht in späteren Durchgang ASCs induziert werden. Es wurde berichtet , dass während der Kultivierung ASCs 16 CD34 + -Zellen bis 3 Passagen enthalten. ASCS neigen dazu, die Expression von CD34 zu verlieren, wie die Zellen passagiert werden, in einer geringen Reaktion auf CG führt.
Mit zentrifuga.......
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Offenlegungen
Wir erklären, dass wir keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit dieser Arbeit haben.
Danksagungen
Diese Forschung wurde durch einen Zuschuss des Korea Health Technology R&D Project durch das Korea Health Industry Development Institute (KHIDI) unterstützt, finanziert vom Ministerium für Gesundheit und Wohlfahrt, Republik Korea (Fördernummer: HI14C2116) und vom Forschungsfonds des Seoul St. Mary's Hospital, der Katholischen Universität von Korea.
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Materialien
ASC Nährmedienmaterialien
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Plasticware | |||
| >100 mm Schale | TPP | 93100 | |
| 60 mm Schale | TPP | 93060 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Einwegpipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Einwegpipette | Falcon | 7543< | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM Low Glucose | Life Technologies | 11885-084 | Wachstumsbasismedien |
| Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | 1% |
| Fötales Rinderserum | Life Technologies | 16000-044 | 10% |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| Chondrogenes Differenzierungsmedium Materialien | |||
| DMEM High Glucose | Life Technologies | 11995 | chondrogene Differenzierungsbasismedien |
| MEM Nicht-essentielle Aminosäuren Lösung (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
| Dexamethason | Sigma Aldrich | D2915 | 100 nM |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | 1% |
| Fötales Rinderserum | Life Technologies | 16000-044 | 1% |
| Ascorbat-2-phosphat | Sigma Aldrich | A8960 | 50 μ g/mL |
| L-Prolin | Sigma Aldrich | P5607 50 | μ g/mL |
| ITS | BD | 354352 1% | |
| Humane TGFβ 1 | Peprotech | 100-21 | 10 ng/mL |
| Materials | |||
| 18 mm Deckglas | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Tween 20 | BIOSESANG | T1027 | |
| Rinderserum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-Kollagen II Antikörper | abcam | ab34712 | 1:100 |
| Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L) Sekundärantikörper, Alexa Fluor 594 Konjugat | Molekulare Sonde | A-11037 | 1:200 |
| DAPI | Molekulare Sonde | D1306 | |
| Prolong Gold Antifade Reagenz | Invitrogen | P36934 | |
| Objektträgerglas, beschichtet | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalkohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid Erststrang-cDNA-Synthesekit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA-Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10x TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1 kb (+) DNA-Leitermarker | Enzynomics | DM003 | |
| Humane Fettstammzellen (ASCs) | Katholische MASTER-Zellen |
Referenzen
- Awad, H. A., Halvorsen, Y. D., Gimble, J. M., Guilak, F. Effects of transforming growth factor beta1 and dexamethasone on the growth and chondrogenic differentiation of adipose-derived stromal cells. Tissue Eng. 9 (6), 1301-1312 (2003).
- Erickson, G. R., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
