La inducción de la lesión por isquemia-reperfusión en la piel de la oreja del ratón para intravital n fotones de imágenes de la respuesta inmune
Summary
Este protocolo describe la inducción de un modelo de isquemia-reperfusión (IR) en la piel de oreja de ratón utilizando sujeción imán. El uso de un modelo de imágenes intravital hecha a la medida, se estudia en las respuestas inflamatorias in vivo después de la reperfusión. La razón fundamental detrás del desarrollo de esta técnica es extender la comprensión de cómo los leucocitos responden a la lesión IR piel.
Abstract
Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent re-oxygenation of the tissues (reperfusion). In the skin, ischemia-reperfusion (IR) is the main contributing factor to the pathophysiology of pressure ulcers. While the cascade of events leading up to the inflammatory response has been well studied, the spatial and temporal responses of the different subsets of immune cells to an IR injury are not well understood. Existing models of IR using the clamping technique on the skin flank are highly invasive and unsuitable for studying immune responses to injury, while similar non-invasive magnet clamping studies in the skin flank are less-than-ideal for intravital imaging studies. In this protocol, we describe a robust model of non-invasive IR developed on mouse ear skin, where we aim to visualize in real-time the cellular response of immune cells after reperfusion via multiphoton intravital imaging (MP-IVM).
Introduction
la lesión por isquemia-reperfusión (IRI) se produce cuando hay una hipoxia transitoria debido a la obstrucción del flujo sanguíneo (isquemia) seguido de una posterior re-oxigenación de los tejidos (reperfusión). En la piel, se cree que por isquemia-reperfusión (IR) para ser uno de los factores que contribuyen a la fisiopatología de las úlceras por presión, en reposo en cama prolongado predispone a los pacientes del hospital a largo plazo a las lesiones. En estos pacientes, la piel y los músculos subyacentes están constantemente expuestos a la presión ejercida sobre el peso áreas de prominencia ósea, lo que resulta en lesiones localizadas que, si no se tratan, pueden llegar a ser necrótico 1.
Los daños que participan en un IRI son dos. Durante la isquemia, la oclusión de los vasos sanguíneos conduce a una caída drástica de la entrega de oxígeno a los tejidos. Esto se traduce en una disminución de ATP y del pH, que inactiva ATPasas implicadas en el metabolismo celular. A su vez, los niveles de calcio celulares pico, y destacaron oc dañadosells sufren apoptosis o necrosis 2. La liberación del contenido intracelular o patrones moleculares asociados de daños (DAMP), al igual que la HMGB1, contribuye a la respuesta inflamatoria 3. El segundo insulto se produce durante la reperfusión. Aunque los niveles de oxígeno y pH se restauran durante la reperfusión, esto da como resultado la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS), que conduce a la oxidación de los lípidos intracelulares, el ADN y las proteínas. En consecuencia, los mediadores pro-inflamatorios se activan, lo que pone en marcha una respuesta inflamatoria secundaria que implica el reclutamiento de células inmunes en el sitio inflamatorio 2. Mientras que la cascada de eventos bioquímicos que conducen a la respuesta inflamatoria ha sido bien descrita, la regulación espacial y temporal de las actividades de las células inmunes no son bien entendidos.
A continuación, describimos un modelo IR robusta en la piel de oreja de ratón usando sencilla sujeción del imán. Junto con las imágenes multifotónica intravital (MP-IVM), queestablecido un modelo para estudiar las respuestas inflamatorias in vivo que se producen después de la reperfusión se lleva a cabo. La razón de ser del desarrollo y el uso de esta técnica es tratar de comprender cómo tanto las células intersticiales e infiltrantes responden a IR en tiempo real.
Los modelos existentes de IR utilizando la técnica de sujeción en el flanco de la piel son altamente invasivo, ya que requieren la implantación quirúrgica de placas de acero en el flanco de la piel, haciendo que sean menos que ideales para estudios inmunológicos 4. Una técnica de sujeción no invasivo similar se ha descrito en el 5,6 ratón piel flanco. Sin embargo, debido a la incorporación del componente de imagen intravital en este método, en vez elegimos la piel de la oreja como el sitio IR específica, ya que evita los movimientos debidos a la respiración y ofrece una estabilidad durante la formación de imágenes 7,8. Por otra parte, subconjuntos de leucocitos que abarcan el intersticio son idénticos entre la piel de la oreja y el flanco de la piel, aunque elnúmeros y proporciones pueden variar ligeramente 9. Por lo tanto, la piel de la oreja representa un sitio de formación de imágenes ideal.
Además, la mayoría de los datos recuperados de estos modelos IRI están limitados a evaluaciones macroscópicas (clasificación de las úlceras) y análisis microscópicos de indicadores de inflamación de punto final 10. Usando este modelo, la visualización en tiempo real de la respuesta celular de los neutrófilos después de la reperfusión en la piel de un ratón reportero fluorescente está habilitada. Un modelo de formación de imágenes oído intravital publicado anteriormente se utiliza 8 con modificaciones adicionales (Figuras 1, 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
Significado
IR es una de las principales causas de las úlceras por presión de la piel. Las etapas tempranas (I y II) de las úlceras por presión describen el estado de la piel humana (en comparación con los tejidos subcutáneos subyacentes y los músculos). Sin embargo, una comprensión de la etiología inmunológica todavía falta. A continuación, presentamos un modelo IR simple y robusto en la piel de oreja de ratón con el fin de llenar este vacío. Simulamos la isquemia mediante la suj…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Thomas Graf for providing us with the LysM-eGFP mice.
Materials
| Mice strains | |||
| Lysozyme-GFP C57BL/6 | Thomas Graf, Center for Genomic Regulation | ||
| C57BL/6-C2J | Jackson Laboratories | 000058 | To be crossed with Lysozyme-GFP to generate albino Lysozyme-GFP for skin imaging |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| PBS | |||
| Viaflex 0.9% (wt/vol) saline | Baxter Healthcare | F8B1323 | |
| Ketamine (100 mg ml−1 ketamine hydrochloride | Parnell | Ketamine is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed | |
| Ilium Xylazil-20 (20 mg ml−1 xylazine hydrochloride) | Troy Laboratories | Xylazil-20 is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed. | |
| Evans blue (10 mg ml−1 in PBS or saline) | Sigma-Aldrich | 46160 | |
| Ultrapurified water | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Insulin syringe with needle | BD | 328838 | |
| Transfer pipettes | Biologix Research Company | 30-0135 | |
| 3M paper masking tape | 3M | 2214 | |
| Deckglaser microscope cover glass (22 mm × 32 mm) | Paul Marienfeld | 101112 | |
| Curved splinter forceps | Aesculap, B. Braun Melsungen | BD312R | |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser | ||
| Medical cotton-tipped applicators | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| C-fold towels | Kimberly-Clark | 20311 | |
| Kimwipes delicate task wipes | Kimtech Science | 34155 | |
| Gold-plated, N42-grade neodymium magnets, 12mm in diameter and 2mm thick | first4magnets | F656S | |
| Plastic guide, 10cm by 1.5cm (polyvinyl chloride material) | fold in half lengthwise, bind with masking tape and slot magnet in | ||
| High vacuum grease | Dow Corning | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | |||
| TriM Scope II single-beam two-photon microscope | LaVision BioTec | ||
| Tunable (680–1,080 nm) Coherent Chameleon Ultra II One Box Ti:sapphire laser (≥3.3 W at 800 nm; pulse length of 140 fs, 80 MHz repetition rate) | Coherent | ||
| Water-dipping objectives (20×, NA = 1.0) | Olympus | XLUMPLFLN20xW | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Miscroscope filter and mirror sets (for imaging GFP, SHG, Evans Blue) | |||
| 495 long-pass | Chroma | T495LPXR | |
| 560 lomg-pass | Chroma | T560LPXR | |
| 475/42 band-pass | Semrock | FF01-475/42-25 | |
| 525/50 band-pass | Chroma | ET525/50m | |
| 655/40 band-pass | Chroma | NC028647 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Skin-imaging stage platform (refer to diagram for assembly) | |||
| A metal base plate (126 mm × 126 mm × 1 mm) | |||
| A brass platform for the ear (79 mm × 19 mm; 1 mm thickness at side, 0.5 mm thickness in the middle; Fig. 1) with slit (1.7 mm × 1 mm; 1.5 mm away from long edge) | |||
| Two plastic blocks (10 mm in height)—for heat insulation | |||
| Curved holder, for positioning the control thermistor on the ear platform | |||
| Interface cable CC-28 with DIN connector and thermistors, one for the temperature control and the other for the temperature monitor | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640106 | connect the interface cable to both resistive heater blocks set at 35°C |
| Resistive heater blocks RH-2 | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640274 | Resistive heater blocks can heat the brass ear platform up to over 100 °C within minutes. Ensure that the control thermistor has been properly secured in the holder in order to avoid overheating. |
| Temperature controller TC-344B for the ear platform | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640101 | |
| Temperature controller TR-200 for mouse heating pad | Fine Science Tools | 21052-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Power supply for TR-200 | Fine Science Tools | 21051-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Heating pad | Fine Science Tools | 21060-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. |
| Animal rectal probe | Fine Science Tools | 21060-01 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. After connecting the rectal probe and heating pad to the temperature controller TR-200, set the temperature to 37 °C |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslip holder | |||
| 2 plastic rods, 1 cm in diameter, 10 cm in length | |||
| 1 plastic adaptor with holes drilled to accommodate rods (refer to diagram) | |||
| 3 plastic tightening screws for keeping plastic rods in place | |||
| 1 metal plate, 6 cm x 2.5 cm, with a 2 cm square cut at 1 end, 2 mm edge away from short edge | |||
| 1 pair of nut and bolt for attaching metal plate to plastic rod | |||
| 1 acrylic base (4 cm x 5 cm x 1.5 cm) with magnet to hold coverslip holder on skin-imaging stage platform. 1 rod is permanently fixed onto base. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging analysis software | |||
| Imaris v8.1.2 | Bitplane | ||
Referenzen
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