Existing methods for the modification of plants have limited applicability. The novel peptide-derived technology proposed here promises both simplicity and efficiency in the introduction of exogenous protein or genes into the desired intracellular compartments of intact plants.
The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as well as new applications in the field of plant biotechnology. Viable methods that currently exist for protein or gene transfer into plant cells, namely Agrobacterium and microprojectile bombardment, have disadvantages of low transformation frequency, limited host range, or a high cost of equipment and microcarriers. The following protocol outlines a simple and versatile method, which employs rationally-designed peptides as delivery agents for a variety of nucleic acid- and protein-based cargoes into plants. Peptides are selected as tools for development of the system due to their biodegradability, reduced size, diverse and tunable properties as well as the ability to gain intracellular/organellar access. The preparation, characterization and application of optimized formulations for each type of the wide range of delivered cargoes (plasmid DNA, double-stranded DNA or RNA, and protein) are described. Critical steps within the protocol, possible modifications and existing limitations of the method are also discussed.
Plant genetic engineering is conventionally used for transferring beneficial traits to plants. In recent years, this technology has been applied to convert plants into bio-factories for the production of pharmaceutically important and commercially valuable proteins, many of which cannot be chemically synthesized and are very costly to produce using animal or microbial systems1. By the introduction of new genes, the plant’s own metabolism can be manipulated for the production of various biopharmaceuticals like antibodies, metabolic enzymes, hormones, antigens or vaccine2.
Established gene transfer technologies for plants are the Agrobacterium-mediated delivery3, bombardment with DNA-coated microprojectiles (biolistics)4, and electroporation5 or polyethylene glycol6 treatment of protoplasts. Techniques requiring protoplasts are generally avoided because they are time-consuming, cumbersome and yield inconsistent results7. As a result, virtually all plant modification work at present utilizes either Agrobacterium or microprojectiles for gene transfer. The Agrobacterium method is more extensively used but not applicable to many economically important plant species. Meanwhile, microprojectile bombardment is more versatile due to a broad range of susceptible plants but requires specialized equipment and often causes severe tissue damage. Furthermore, these methods involve either a random (biolistics) or complex (Agrobacterium) delivery mechanism and have variable transformation rates8. Hence, a novel plant transformation technology that is simple yet effective, and applicable to different plant types is required.
Currently, plants are subjected to genetic modification primarily by the delivery of exogenous DNA encoding a desired trait, rather than by direct delivery of a target protein. The higher stability of DNA over proteins is a prime advantage; nevertheless, potential problems associated with DNA delivery include the random insertion of exogenous DNA into the plant genome and unintended transmission of antibiotic resistance genes to pathogenic bacteria via horizontal gene transfer9. For genome-editing purposes, the ability to edit plant genomes without introducing foreign DNA into cells may circumvent regulatory concerns related to genetically modified plants. Thus, an alternative DNA-free strategy for the modification of plants by direct delivery of protein will be able to cater to these needs.
Here we introduce a peptide-based system, originally developed for human gene therapy10-14, for the targeted delivery of exogenous genes or proteins in intact plants. Peptides are able to protect DNA from nuclease degradation and can mediate gene transfer across cell as well as organellar membranes15-17. They also have diverse and tunable properties besides being non-cytotoxic18-20. More importantly, with the use of peptides, genes can be precisely targeted to intracellular organelles such as the mitochondria21 or plastids (chloroplasts)22 for expression-a task not achievable by biolistic or Agrobacterium-mediated transformation. Depending on the cargo type, this new plant modification technology can be exploited to deliver proteins23 and either express (plasmid21,24 or double-stranded DNA25) or down-regulate (double-stranded RNA26) specific genes within the plant, throughout its cytosolic space24-26 or within a specific organellar compartment21. The designed carrier peptides consist of a cationic domain in the form of either polylysine (K8) or polylysine-co-histidine (KH)9 for binding and/or condensation of negatively-charged cargoes, which is conjugated to cell penetrating (BP100 peptide) or mitochondria transit (Cytcox peptide) sequences.
経験的に同定されているプロトコル内の重要なステップが説明されています。シリンジ浸潤によって、ペプチドベースの製剤は、気孔を介して植物の葉の内部空域内に導入されます。植物は、すなわち気孔開口部を助長している条件であるときにソリューションの最大の取り込みを確実にするために、浸透プロセスが実施されるべきである。、十分な水で、ライト期間中に提供されました。トランスフェクション複合体の準備に関しては、(ミトコンドリアを標的DNA送達のための)2つのペプチドの組み合わせを伴う製剤について、各成分の添加順序は重要であり、反転すべきではありません。
手続きに多くのもっともらしいの変更があります。植物細胞の浸潤のための別のオプションは、以下を含む植物全体および/または部分的な組織に複雑なソリューションを導入することができる真空浸潤を使用すること、です頂端分裂組織。この代替的な手順については、苗木は、トランスフェクション溶液に浸漬され、真空によって発生した圧力に基づいて、ペプチド – カーゴ複合体は、気孔を通って植物細胞(吉住、T.、未発表データ)に強制されます。
動物細胞を用いた研究に基づいて、一過性の遺伝子発現は、より高いDNA濃度が29-31で増加することが示されています。 DNAに対するペプチドの比は、複合体の生物物理学的特性(サイズ、表面電荷)に影響することに注意することはトランスフェクション効率に影響を与える( 図4)は 、重要です。従って、最適比も増大DNA濃度で維持される必要があります。
遺伝子/タンパク質の送達剤としてのペプチドの使用における主な利点の1つは、その配列が所望の機能を果たすためにチューニングすることが適しているということです。例えば、キャリアペプチドのミトコンドリア標的化ドメインは、このスタッドに記載しますyは、これらの細胞小器官に局在化のため葉緑体またはペルオキシソーム標的化配列で置換することができます。葉緑体の形質転換は、微粒子銃32-34を使用して、いくつかの植物では可能であるが、 アグロバクテリウムやバイオリスティック法のいずれも、核( 表2)に加えて、ミトコンドリアまたは他の細胞小器官に遺伝子を導入することができます。
アグロバクテリウムベースの方法( 表2)とは異なり、ペプチドベースのトランスフェクションには、剛性宿主範囲の制限は、ありません。これまで、 シロイヌナズナのトランスフェクションのための製剤は、 ベンサミアナタバコ及びポプラ( 表1)を 、最適化されているが、この方法はまた、 タバコに適用することができます トマト品種マイクロトム、米(予備実験に基づく)、および他の単子葉及び双子葉植物。
ペプチドが使用されるとき、まだように、導入遺伝子の大きさには既知の制限は存在しませんトランスフェクションベクター。対照的に、大きなDNA分子は、 アグロバクテリウム媒介法35,36の形質転換効率、及び37-39に報告されている約200κBのトランスジーンのためのサイズの上限を減少させることが見出されています。微粒子銃を使用して、一方で、大きなDNA断片を植物38に調製または送達中に剪断することができます。上限は、これまでに遺伝子銃形質転換のために決定されていないが、物理的な制約がはるかに少ない150よりKB 40に転送することができるDNAの大きさを制限することが見出されています。上述のアグロバクテリウムまたは微粒子銃のいずれかを使用する既存のアプローチと比較して、遺伝子導入のためのペプチドベースのシステムを使用することの主な利点は、 表2に要約されています。
それが立つようにいくつかの制限は、この方法のために存在します。まず、そのようなMITなどの特定の細胞小器官へのpDNAの配信をターゲットに効率は低かったもののochondria、DNA結合、細胞透過性およびオルガネラ輸送の配列の単純な組み合わせによって可能と証明されています。導入遺伝子の発現は、細胞内のミトコンドリアの小集団において、共焦点顕微鏡によって、検出することができます。細胞/細胞小器官膜を通過する複数の複合体の移動を高める、および(ii)発現のための標的細胞小器官への解離およびキャリアペプチドのpDNAの伝達を改善(I):従って、さらなる修正は必要にしています。第二に、このDNAの送達システムを使用して、外因性のレポーター遺伝子の一過性発現は、正常細胞の細胞質ゾルおよびミトコンドリア区画に達成されました。植物の核/オルガネラゲノム中に導入された遺伝子の安定した取り込みおよび発現が原因で、適切な選択方法が存在しないために、しかし、まだ確立されていません。
改善やさらなる日間領域があることを認めつつevelopmentは、ここに記載のペプチド由来の戦略は、多様な植物の種類にさまざまな貨物の配達のための道を開いた、シンプルで汎用性の高い技術のまま。
The authors have nothing to disclose.
著者らは、独立行政法人科学技術振興機構探索研究先端技術(JST-ERATO)、新エネルギー・産業技術総合開発機構(NEDO)、及び府省の戦略的イノベーション促進プログラム(SIP)、日本からの資金を承認したいと思います。
(KH)9-BP100 peptide | Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute | N/A | Sequence: KHKHKHKHKHKHKHKH- KHKKLFKKILKYL |
(BP100)2-K8 peptide | Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute | N/A | Sequence: KKLFKKILKYLKKLFKKIL- KYLKKKKKKKK |
BP100 peptide | Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute | N/A | Sequence: KKLFKKILKYL |
Cytcox-(KH)9 peptide | Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute | N/A | Sequence: MLSLRQSIRFFKKHKHKH- KHKHKHKHKHKH |
P35S-GFP(S65T)-TNOS and P35S-RLuc-TNOS | N/A | N/A | Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Biomacromolecules 2013, 14, 10) |
pDONR-cox2:gfp and pDONR-cox2:rluc | N/A | N/A | Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of cox2 mitochondrial-specific promoter (Ref: Chuah et al. Sci Rep 2015, 5, 7751) |
dsDNA (PCR-amplified from pBI221-P35S-Rluc-TNOS) | N/A | N/A | Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Plant Biotechnol 2015, 32, 39) |
GFP5 siRNA | N/A | N/A | For RNA interference-mediated silencing of green fluorescent protein (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027) |
CHS siRNA | N/A | N/A | For RNA interference-mediated silencing of chalcone synthase (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027) |
1 mL and 10 mL Plastic Syringes | TERUMO Corporation | SS-01T, SS-10ESZ | |
1.5 mL Microcentrifuge Tube | AS ONE Corporation | 151212 | |
96-Well Flat-Bottom Plate | Asahi Glass Co., Ltd. | 3860-096 | |
Adhesive Tape | Sekisui Chemical Co., Ltd. | No. 835 | |
Alcohol Dehydrogenase | Sigma-Aldrich Co., LLC. | A-7011 | |
Atomic Force Microscope | Seiko Instruments Inc. | SPI3800, SPA 300HV | |
Atomic Force Microscope | Hitachi High-Tech Science Corporation | AFM5300E | |
BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific Inc. | 23227 | |
Cantilever | Hitachi High-Tech Science Corporation | K-A102001593 | |
Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
Cork Borer | Sigma-Aldrich Co., LLC. | Z165220 | For excision of leaves into 1-cm diameter disks |
Coverslip | Matsunami Glass Ind., Ltd. | C02261 | |
Cuvette | Sarstedt | 759116 | |
Folded Capillary Cell | Malvern Instruments, Ltd. | DTS1070 | |
Forceps | Shimizu Akira Inc. | Stainless pincet 150 | |
Homogenization Pestle | Ieda Trading Corp. | 9993 | |
Mica | Nisshin EM Co., Ltd. | LC23Z | |
Microcentrifuge | Beckman Coulter | BKA46472 | |
Microplate Reader | Molecular Devices Corporation | Spectra MAX M3 | |
Microscope Slide | Matsunami Glass Ind., Ltd. | S011120 | |
Pipette | Eppendorf Research® plus | 3120000909 | |
Pipette Tips | AS ONE Corporation | 2-5138-01, 2-5138-02, 2-5138-03 | |
Plastic Petri Dish | AS ONE Corporation | 1-7484-01 | |
Renilla Luciferase Assay Kit | Promega corporation | E2810 | |
Rhodamine B Isothiocyanate | Sigma-Aldrich Co., LLC. | 283924 | |
RNase-Free Water | Qiagen | 129112 | |
Sodium Carbonate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 199-01585 | |
Surgical Blade and Handle | FEATHER Safety Razor Co., Ltd. | Stainless steel No. 14 (blade), No. 3L (handle) | |
Syringe Tip Cap | Musashi Engineering Inc. | NC-3E | |
Weighing Balance | Sartorius | CPA225D | |
Zeta Potentiometer | Malvern Instruments, Ltd. | Zetasizer Nano-ZS |