Existing methods for the modification of plants have limited applicability. The novel peptide-derived technology proposed here promises both simplicity and efficiency in the introduction of exogenous protein or genes into the desired intracellular compartments of intact plants.
The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as well as new applications in the field of plant biotechnology. Viable methods that currently exist for protein or gene transfer into plant cells, namely Agrobacterium and microprojectile bombardment, have disadvantages of low transformation frequency, limited host range, or a high cost of equipment and microcarriers. The following protocol outlines a simple and versatile method, which employs rationally-designed peptides as delivery agents for a variety of nucleic acid- and protein-based cargoes into plants. Peptides are selected as tools for development of the system due to their biodegradability, reduced size, diverse and tunable properties as well as the ability to gain intracellular/organellar access. The preparation, characterization and application of optimized formulations for each type of the wide range of delivered cargoes (plasmid DNA, double-stranded DNA or RNA, and protein) are described. Critical steps within the protocol, possible modifications and existing limitations of the method are also discussed.
Plant genetic engineering is conventionally used for transferring beneficial traits to plants. In recent years, this technology has been applied to convert plants into bio-factories for the production of pharmaceutically important and commercially valuable proteins, many of which cannot be chemically synthesized and are very costly to produce using animal or microbial systems1. By the introduction of new genes, the plant’s own metabolism can be manipulated for the production of various biopharmaceuticals like antibodies, metabolic enzymes, hormones, antigens or vaccine2.
Established gene transfer technologies for plants are the Agrobacterium-mediated delivery3, bombardment with DNA-coated microprojectiles (biolistics)4, and electroporation5 or polyethylene glycol6 treatment of protoplasts. Techniques requiring protoplasts are generally avoided because they are time-consuming, cumbersome and yield inconsistent results7. As a result, virtually all plant modification work at present utilizes either Agrobacterium or microprojectiles for gene transfer. The Agrobacterium method is more extensively used but not applicable to many economically important plant species. Meanwhile, microprojectile bombardment is more versatile due to a broad range of susceptible plants but requires specialized equipment and often causes severe tissue damage. Furthermore, these methods involve either a random (biolistics) or complex (Agrobacterium) delivery mechanism and have variable transformation rates8. Hence, a novel plant transformation technology that is simple yet effective, and applicable to different plant types is required.
Currently, plants are subjected to genetic modification primarily by the delivery of exogenous DNA encoding a desired trait, rather than by direct delivery of a target protein. The higher stability of DNA over proteins is a prime advantage; nevertheless, potential problems associated with DNA delivery include the random insertion of exogenous DNA into the plant genome and unintended transmission of antibiotic resistance genes to pathogenic bacteria via horizontal gene transfer9. For genome-editing purposes, the ability to edit plant genomes without introducing foreign DNA into cells may circumvent regulatory concerns related to genetically modified plants. Thus, an alternative DNA-free strategy for the modification of plants by direct delivery of protein will be able to cater to these needs.
Here we introduce a peptide-based system, originally developed for human gene therapy10-14, for the targeted delivery of exogenous genes or proteins in intact plants. Peptides are able to protect DNA from nuclease degradation and can mediate gene transfer across cell as well as organellar membranes15-17. They also have diverse and tunable properties besides being non-cytotoxic18-20. More importantly, with the use of peptides, genes can be precisely targeted to intracellular organelles such as the mitochondria21 or plastids (chloroplasts)22 for expression-a task not achievable by biolistic or Agrobacterium-mediated transformation. Depending on the cargo type, this new plant modification technology can be exploited to deliver proteins23 and either express (plasmid21,24 or double-stranded DNA25) or down-regulate (double-stranded RNA26) specific genes within the plant, throughout its cytosolic space24-26 or within a specific organellar compartment21. The designed carrier peptides consist of a cationic domain in the form of either polylysine (K8) or polylysine-co-histidine (KH)9 for binding and/or condensation of negatively-charged cargoes, which is conjugated to cell penetrating (BP100 peptide) or mitochondria transit (Cytcox peptide) sequences.
Les étapes critiques au sein du protocole qui ont été identifiées de façon empirique sont discutées. Par infiltration seringue, les formulations à base de peptides sont introduits dans les espaces aériens à l'intérieur de la feuille de la plante à travers les stomates. Pour assurer l' absorption maximale de la solution, le processus d'infiltration doit être effectuée lorsque les plantes sont dans des conditions qui sont propices à l' ouverture stomatique ie., Fournis avec suffisamment d' eau et pendant la période de lumière. En ce qui concerne la préparation des complexes de transfection, pour les formulations qui impliquent une combinaison de deux peptides (pour la délivrance d'ADN mitochondrial ciblée), la séquence d'addition de chaque composant est essentielle et ne doit pas être inversée.
Il existe de nombreuses modifications vraisemblables de la procédure. Une autre option pour l'infiltration des cellules végétales est l'utilisation d'une infiltration sous vide, qui est capable d'introduire la solution du complexe dans des plantes entières et / ou partielles, y compris les tissusméristème apical. Pour cette procédure alternative, les plants sont submergées dans la solution de transfection, et en fonction de la pression générée par le vide, les complexes de peptide-cargo sont contraints par les stomates et dans les cellules végétales (Yoshizumi, T., données non publiées).
L' expression transitoire du gène, basée sur des études utilisant des cellules animales, a été démontré que l'augmentation des concentrations d' ADN plus élevées avec 29-31. Il est important de noter que le rapport du peptide à l' ADN affecte les propriétés biophysiques (taille, la charge de surface) , des complexes (figure 4), qui influe sur l' efficacité de transfection; Par conséquent, le rapport optimal doit être maintenu, même avec une concentration accrue de l'ADN.
L'un des principaux avantages de l'utilisation des peptides comme un agent de prestation gène / protéine est que sa séquence est prête à accorder à remplir une fonction souhaitée. Par exemple, le domaine de ciblage mitochondrial du peptide de support décrit dans ce ploty peuvent être remplacées par des séquences chloroplastiques ou peroxysomaux ciblage pour la localisation de ces organites. Tandis que la transformation de chloroplastes est possible de plusieurs plantes en utilisant la biolistique 32-34, ni Agrobacterium , ni la méthode biolistique pourraient introduire des gènes dans les mitochondries et autres organites en dehors du noyau (tableau 2).
Il n'y a pas de limitations gamme d' hôtes rigides pour la transfection à base de peptides, à la différence de la méthode à base d' Agrobacterium (tableau 2). Jusqu'à présent, les formulations pour la transfection de A. thaliana, N. benthamiana et le peuplier ont été optimisés (tableau 1), mais la méthode peut également être appliquée pour Nicotiana tabacum, cultivar de tomate micro-Tom, le riz (à partir d'expériences préliminaires) et d'autres plantes mono- et dicotylédones.
Jusqu'à présent, il n'y a pas de limitation connue de la taille du transgène lorsque les peptides sont utilisés, undes vecteurs de transfection. En revanche, les grandes molécules d'ADN ont été trouvés pour réduire l'efficacité de transformation médiées par Agrobacterium méthodes 35,36, et une limite de taille supérieure pour les transgènes d'environ 200 kb a été rapportée 37-39. En utilisant la biolistique, d'autre part, de grands fragments d'ADN peuvent être cisaillées lors de la préparation ou de la livraison dans des plantes 38. Bien qu'aucune limite supérieure n'a été déterminée pour une transformation biolistique jusqu'à présent, des contraintes physiques ont été trouvées pour limiter la taille de l' ADN qui peut être transféré à moins de 150 kb 40. Les principaux avantages de l' utilisation du système à base de peptides pour le transfert de gènes par rapport aux approches existantes employant soit Agrobacterium ou le bombardement de microprojectiles, discutées ci – dessus, sont résumés dans le tableau 2.
Quelques limitations existent pour cette méthode telle qu'elle est. En premier lieu, la livraison de l'ADNp ciblé vers des organites spécifiques, tels que la mitochondria, a été prouvée possible par une simple combinaison de séquences de pénétration des cellules et un organite transit liaison à l'ADN, bien que l'efficacité a été faible. L'expression du transgène peut être détectée, par microscopie confocale, seule une petite population de cellules au sein de la mitochondrie. Par conséquent, d'autres modifications sont nécessaires pour: (i) améliorer la translocation des plus complexes à travers la cellule / membrane des organites, et (ii) améliorer la dissociation et le transfert de ADNp du peptide porteur dans l'organite cible pour l'expression. En second lieu, l'utilisation de ce système de délivrance d'ADN, l'expression transitoire des gènes rapporteurs exogènes a été atteint avec succès dans le compartiment cytosolique et mitochondriale des cellules. incorporation stable et l'expression des gènes introduits dans le nucléaire de la plante / génome organites ont pas encore été établie mais, en raison de l'absence de stratégies de sélection appropriés.
Tout en reconnaissant qu'il existe des zones d'amélioration ou encore développement, la stratégie de peptide dérivé décrit ici reste une technique simple et polyvalent qui a ouvert la voie à la livraison de divers cargaisons en types de plantes diverses.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à remercier le financement du Japan Science and Technology Agency recherche exploratoire pour la technologie avancée (JST-ERATO), la Nouvelle Energie et Industrial Technology Development Organization (NEDO), et le Programme de promotion de l'innovation stratégique Croix-ministérielle (SIP), le Japon .
(KH)9-BP100 peptide | Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute | N/A | Sequence: KHKHKHKHKHKHKHKH- KHKKLFKKILKYL |
(BP100)2-K8 peptide | Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute | N/A | Sequence: KKLFKKILKYLKKLFKKIL- KYLKKKKKKKK |
BP100 peptide | Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute | N/A | Sequence: KKLFKKILKYL |
Cytcox-(KH)9 peptide | Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute | N/A | Sequence: MLSLRQSIRFFKKHKHKH- KHKHKHKHKHKH |
P35S-GFP(S65T)-TNOS and P35S-RLuc-TNOS | N/A | N/A | Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Biomacromolecules 2013, 14, 10) |
pDONR-cox2:gfp and pDONR-cox2:rluc | N/A | N/A | Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of cox2 mitochondrial-specific promoter (Ref: Chuah et al. Sci Rep 2015, 5, 7751) |
dsDNA (PCR-amplified from pBI221-P35S-Rluc-TNOS) | N/A | N/A | Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Plant Biotechnol 2015, 32, 39) |
GFP5 siRNA | N/A | N/A | For RNA interference-mediated silencing of green fluorescent protein (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027) |
CHS siRNA | N/A | N/A | For RNA interference-mediated silencing of chalcone synthase (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027) |
1 mL and 10 mL Plastic Syringes | TERUMO Corporation | SS-01T, SS-10ESZ | |
1.5 mL Microcentrifuge Tube | AS ONE Corporation | 151212 | |
96-Well Flat-Bottom Plate | Asahi Glass Co., Ltd. | 3860-096 | |
Adhesive Tape | Sekisui Chemical Co., Ltd. | No. 835 | |
Alcohol Dehydrogenase | Sigma-Aldrich Co., LLC. | A-7011 | |
Atomic Force Microscope | Seiko Instruments Inc. | SPI3800, SPA 300HV | |
Atomic Force Microscope | Hitachi High-Tech Science Corporation | AFM5300E | |
BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific Inc. | 23227 | |
Cantilever | Hitachi High-Tech Science Corporation | K-A102001593 | |
Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
Cork Borer | Sigma-Aldrich Co., LLC. | Z165220 | For excision of leaves into 1-cm diameter disks |
Coverslip | Matsunami Glass Ind., Ltd. | C02261 | |
Cuvette | Sarstedt | 759116 | |
Folded Capillary Cell | Malvern Instruments, Ltd. | DTS1070 | |
Forceps | Shimizu Akira Inc. | Stainless pincet 150 | |
Homogenization Pestle | Ieda Trading Corp. | 9993 | |
Mica | Nisshin EM Co., Ltd. | LC23Z | |
Microcentrifuge | Beckman Coulter | BKA46472 | |
Microplate Reader | Molecular Devices Corporation | Spectra MAX M3 | |
Microscope Slide | Matsunami Glass Ind., Ltd. | S011120 | |
Pipette | Eppendorf Research® plus | 3120000909 | |
Pipette Tips | AS ONE Corporation | 2-5138-01, 2-5138-02, 2-5138-03 | |
Plastic Petri Dish | AS ONE Corporation | 1-7484-01 | |
Renilla Luciferase Assay Kit | Promega corporation | E2810 | |
Rhodamine B Isothiocyanate | Sigma-Aldrich Co., LLC. | 283924 | |
RNase-Free Water | Qiagen | 129112 | |
Sodium Carbonate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 199-01585 | |
Surgical Blade and Handle | FEATHER Safety Razor Co., Ltd. | Stainless steel No. 14 (blade), No. 3L (handle) | |
Syringe Tip Cap | Musashi Engineering Inc. | NC-3E | |
Weighing Balance | Sartorius | CPA225D | |
Zeta Potentiometer | Malvern Instruments, Ltd. | Zetasizer Nano-ZS |