El fósforo-31 espectroscopía de resonancia magnética: una herramienta para medir<em> En Vivo</em> Capacidad de la fosforilación oxidativa mitocondrial en el músculo esquelético humano

Summary

This work demonstrates the feasibility of an in vivo phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (³¹PMRS) technique to quantify mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity in human skeletal muscle.

Abstract

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo and noninvasively in humans via phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (³¹PMRS). However, the approach has not been widely adopted in translational and clinical research, with variations in methodology and limited guidance from the literature. Increased optimization, standardization, and dissemination of methods for in vivo ³¹PMRS would facilitate the development of targeted therapies to improve OXPHOS capacity and could ultimately favorably impact cardiovascular health. ³¹PMRS produces a noninvasive, in vivo measure of OXPHOS capacity in human skeletal muscle, as opposed to alternative measures obtained from explanted and potentially altered mitochondria via muscle biopsy. It relies upon only modest additional instrumentation beyond what is already in place on magnetic resonance scanners available for clinical and translational research at most institutions. In this work, we outline a method to measure in vivo skeletal muscle OXPHOS. The technique is demonstrated using a 1.5 Tesla whole-body MR scanner equipped with the suitable hardware and software for ³¹PMRS, and we explain a simple and robust protocol for in-magnet resistive exercise to rapidly fatigue the quadriceps muscle. Reproducibility and feasibility are demonstrated in volunteers as well as subjects over a wide range of functional capacities.

Introduction

El objetivo de este trabajo es describir un método reproducible para medir de forma no invasiva in vivo la función mitocondrial en el músculo esquelético en individuos que poseen una amplia gama de habilidades. deterioro mitocondrial aberrante es un sello distintivo de una amplia gama de síndromes metabólicos y enfermedades genéticas, de las condiciones comunes como el envejecimiento y la diabetes a enfermedades raras tales como la ataxia de Friedreich.

Síndrome metabólico y disfunción mitocondrial

El síndrome metabólico se ha demostrado que alteran la función mitocondrial, deprimir la fosforilación oxidativa del músculo esquelético, y dar lugar a almacenamiento de lípidos ectópico en el músculo esquelético ^{1, 2.} Como orgánulos críticos que regulan metabólica y la homeostasis de la energía, las mitocondrias están implicados en la fisiopatología de la obesidad ^{3, 4, 5} resistencia a la insulina </sup>, Diabetes mellitus tipo 2 (DM2) ^{6, 7,} relacionadas con la diabetes micro ^{8, 9, 10, 11} y macrovasculares ^{12, 13,} y no alcohólicas hígado graso (NAFLD) ^{14, 15, 16,} entre otros .Insulin resistencia se caracteriza por profundos cambios en la actividad mitocondrial del músculo esquelético, incluyendo disminución de la frecuencia mitocondrial de los ácidos tricarboxílicos (TCA) de flujo, tasa de síntesis de ATP y citrato sintasa y NADH: _O2 actividad oxidorreductasa ^5. Una hipótesis es que estas alteraciones podrían deberse a la acumulación de metabolitos de ácidos grasos libres (AGL) en el músculo, que se aumentan notablemente durante la obesidad y otra obesidad-renfermedades eufóricos ^{2, 17.} La exposición de músculo para AGL elevados y productos intermedios de lípidos puede disminuir la expresión de genes en la vía oxidativa de los lípidos, así como el ciclo de TCA y la cadena de transporte de electrones (ETC) ^18. Esta reducción de la capacidad de la fosforilación oxidativa mitocondrial del músculo esquelético en la fijación de una sobrecarga de lípidos se acompaña de una disminución en el cuantitativo (contenido y la biogénesis de las mitocondrias) ¹⁹ y la función cualitativa de las mitocondrias del músculo esquelético ^20. La exposición de los miocitos del músculo esquelético y de ácidos grasos libres conduce a la resistencia grave a la insulina, y aumento de la captación de FFA en el músculo está asociada con resistencia a la insulina en los seres humanos y roedores ^21. La ceramida intermedios de lípidos y diacilglicerol (DAG) han demostrado inhibir directamente la vía de señalización de la insulina mediante la alteración de la actividad de quinasas, como la proteína quinasa C y protein quinasa B ^21. Por lo tanto, las moléculas de derivados de lípidos parecen desempeñar un papel destacado en el desarrollo de la resistencia a la insulina del esqueleto muscular y DM2. Sin embargo, no queda claro si los cambios en la capacidad mitocondrial son una causa o una consecuencia de la resistencia a la insulina ^22.

La disfunción mitocondrial y la Ataxia de Friedrich

Disminución de la fosforilación oxidativa también pueden surgir de defectos genéticos. Ataxia de Friedrich (FA), la forma más común de ataxia hereditaria, es un trastorno genético provocado por una mutación en el frataxina (FXN) de genes, lo que resulta en la acumulación de hierro intra-mitocondrial, la producción de especies reactivas de oxígeno, y las anormalidades de la fosforilación oxidativa ^{23, 24, 25, 26.} Este importante descubrimiento ha conducido al desarrollo de terapias dirigidas, which objetivo de mejorar la función mitocondrial a nivel subcelular. A pesar de este conocimiento, ha habido un desarrollo limitado de in vivo, marcadores biológicos reproducibles para la investigación clínica FA. De hecho, una barrera crítica en la evaluación efectiva de las terapias dirigidas en FA es la incapacidad para realizar un seguimiento de los cambios en la función mitocondrial. medidas funcionales actuales, por ejemplo, puede identificar disminución del gasto cardíaco; sin embargo, son incapaces de determinar el nivel en el que se produce la disfunción (Figura 1). El desarrollo de un marcador fiable de la función mitocondrial que puede ser utilizado para identificar y evaluar la progresión de la enfermedad en la ataxia de Friedrich es crucial para calibrar el impacto mecánico correspondiente de terapias dirigidas.

Deterioro de la fosforilación oxidativa y la disfunción cardíaca

la función mitocondrial aberrante, ya sea adquirida o genética, podría contribuir al desarrollo o la progresión de cardidisfunción ac. En las condiciones de sobrecarga de presión y la insuficiencia cardíaca, los interruptores de preferencia de sustrato de energía primaria de FFA a la glucosa. Esto se asocia con una disminución de la actividad de ETC y la fosforilación oxidativa ^27. La fisiopatología de la bioenergética mitocondrial en la disfunción cardíaca puede ser diferente dependiendo del origen primario del defecto mitocondrial. La diabetes y el síndrome metabólico resulta en alteraciones mitocondriales en el miocardio, como la biogénesis deteriorado y el metabolismo de los ácidos grasos, los cuales conducen a la reducida flexibilidad de soportes, la eficiencia energética, y, finalmente, la disfunción diastólica ^{28, 29.} En FA, por otro lado, una deficiencia de frataxina resultado en la acumulación de hierro mitocondrial significativa en cardiomiocitos ^{30, 31.} La acumulación de hierro conduce a la producción de radicales libres a través de la reacción de Fenton ^{32 <}/ Sup> y aumenta la probabilidad de daño de los cardiomiocitos inducida por radicales. La acumulación de hierro Intra-mitocondrial también se asocia con un aumento de la sensibilidad al estrés oxidativo y una capacidad oxidativa reducida ^{30, 31.} La acumulación de hierro y la posterior función mitocondrial aberrante, debido a la deficiencia de frataxina, por lo tanto, pueden ser responsables de la energética cardíacas y alteraciones observadas en la miocardiopatía FA ^{33, 34.} También es interesante notar que la capacidad oxidativa reducida en las mitocondrias del músculo esquelético es paralela a la intolerancia al ejercicio y reducción de la capacidad metabólica en la insuficiencia cardíaca (HF) ^35. Medición de la capacidad de la fosforilación oxidativa del músculo esquelético, como se detalla en el presente documento, es fácilmente implementable y robusto; junto con la importancia de la fosforilación oxidativa del músculo esquelético en la IC, estas características lo convierten en un atractivo biomarcador en estudios completos sobre los oyenenfermedad t ^36.

La fosforilación oxidativa y la alteración de la disfunción cardíaca acompañante no es un aspecto insignificante del metabolismo y enfermedad mitocondrial. Los sujetos con diabetes y enfermedades metabólicas están en un riesgo mayor de desarrollar enfermedades cardiovasculares y tienen exceso de mortalidad después de un infarto de miocardio (IM) ^{37, 38, 39, 40, 41;} más de la mitad de los sujetos con AF tienen cardiomiopatía, y muchos mueren de arritmia cardíaca o insuficiencia cardíaca ^42. Por lo tanto, la cuantificación de la reducción de la fosforilación oxidativa no sólo podría permitir la detección y el tratamiento de la disfunción cardiaca temprana, pero también podría aliviar una carga importante clínica en estas enfermedades.

Las terapias dirigidas a aumentar directamente la capacidad de la fosforilación oxidativa es un área prometedora para mejorar el tratamiento de sujetos, cuando planeesTher la causa de la disfunción metabólica es genética o adquirida. En la actualidad, el desarrollo de nuevos fármacos dirigidos a dianas que, o bien alivian la función mitocondrial anormal ⁴³ o corregir el defecto genético primario ⁴⁴ puede mejorar la característica bioenergética trastornada de la FA. En el caso de la disfunción mitocondrial adquirido, el aumento de la actividad física puede mejorar mitocondrial función ^{45, 46, 47.}

³¹ El fósforo Espectroscopia de Resonancia Magnética como biomarcador no invasivo de la función mitocondrial

Independientemente de la terapia de la prueba, un sistema integrado de evaluación in vivo de la bioenergética del músculo esquelético es una herramienta fundamental para evaluar el impacto de las intervenciones dirigidas, sobre todo en sujetos con intolerancia al ejercicio intenso o la incapacidad para someterse a metabo convencionallas pruebas lic. Espectroscopia de resonancia magnética sintonizado a fósforo ⁽³¹ PMRS), un núcleo endógeno encontrado en varios sustratos de alta energía dentro de las células en todo el cuerpo, se ha utilizado para cuantificar la capacidad oxidativa mitocondrial usando una variedad de enfoques, incluyendo en-imán protocolos de ejercicio de recuperación y protocolos de estimulación muscular ^48. Los protocolos de ejercicios de recuperación dependen de una variedad de aparatos que van en complejidad desde ergómetros compatibles con resonancia magnética que regulan y miden la carga de trabajo para configuraciones simples de las correas y las almohadillas que permiten tipo de ráfaga-resistivo y el ejercicio cuasi-estática. Uno de los objetivos principales de cualquiera de estos protocolos es producir un desequilibrio energético para los que se cumple inicialmente la demanda de trifosfato de adenosina (ATP) a través de la descomposición enzimática de la fosfocreatina (PCr) a través de la reacción de la creatina quinasa ^49. Tras el cese de ejercicio, la tasa de producción de ATP está dominado por pho oxidativosphorylation y representa el máximo de la capacidad in vivo de la mitocondria ^50. Por otra parte, la fosforilación oxidativa durante la recuperación después del ejercicio puede describirse mediante una reacción de velocidad de primer orden ^51. Por tanto, la recuperación post-ejercicio de la PCR puede ser cuantificado mediante la instalación de una constante de tiempo exponencial (τ _PCR), con menores valores de τ _PCr que representan una mayor capacidad para la síntesis de ATP oxidativo. Se han hecho esfuerzos significativos para validar ³¹ PMRS contra ex vivo y medidas más directas de la fosforilación oxidativa y demostrar el potencial de aplicabilidad clínica de esta técnica ^{52, 53, 54, 55.}

En particular, el protocolo descrito en este trabajo se puede implementar en escáneres clínicamente disponibles, y que ha sido ampliamente validado como un biomarcador no invasivo of la función mitocondrial ^56. Sin embargo, un protocolo de ejercicio PMRS ³¹ optimizado para su aplicación a los individuos con diferentes niveles de gravedad de la discapacidad neuromuscular o la movilidad no ha sido bien establecida ^57. A, protocolo de ejercicio ampliamente aplicable bien definido y ³¹ técnica PMRS serían particularmente útiles en la evaluación de las enfermedades con anomalías fundamentales en la función mitocondrial.

Varios estudios anteriores han explorado las aplicaciones de las técnicas no invasivas para cuantificar la función mitocondrial en sujetos. Por ejemplo, estas técnicas han demostrado la fosforilación oxidativa alterada en sujetos con diabetes tipo 2 ^36. Lodi et al. primero probado la viabilidad de las técnicas de PMRS en sujetos con FA y se encontró que 1) el defecto genético fundamental en FA afecta la fosforilación oxidativa del músculo esquelético y 2) el número de triplete GAA se repite es inversamente proporcional al músculo esquelético OXPHOS ^33. Más recientemente, Nachbauer et al. PMRS utiliza como una medida de resultado secundaria en un ensayo de la droga FA con 7 temas. Los tiempos de recuperación de PCR fueron significativamente más largo en comparación con los controles sujetos, reafirmando el trabajo anterior de Lodi y que indica que los efectos de la expresión aberrante de la frataxina en FA puede resultar en una disminución de la capacidad mitocondrial que es detectable usando técnicas PMRS ^58.

Los métodos fiables para definir adecuadamente vivo en función del músculo esquelético en un rentable, y de manera factible y reproducible son críticos para mejorar los resultados de sujetos en una serie de enfermedades que afectan a la función mitocondrial.

Este trabajo describe un procedimiento robusto para la obtención in vivo máxima capacidad oxidativa del músculo esquelético utilizando ³¹ PMRS. El protocolo de ejercicio en-imán es bien tolerado por los individuos que abarcan una amplia gama de física y funcionalismol habilidades y produce a una configuración simplificada sujetos utilizando equipos de bajo costo y ampliamente disponible.

Protocol

Este protocolo se aprobó por y sigue las directrices de la Junta de Revisión Institucional Universidad Estatal de Ohio para la investigación con sujetos humanos. Es de vital importancia que todos los procedimientos que implican equipos de RM son realizadas por personal debidamente capacitado que se adhieren a los más altos estándares de seguridad MR 59. 1. Materiales y Preparación Asegúrese de que todos los materiales necesarios están disponi…

Representative Results

Estudio de reproducibilidad Seis voluntarios (4 hombres y 2 mujeres, edad media: 24,5 ± 6,2 años) con ningún corazón auto-reporte, metabólico o enfermedad mitocondrial se sometieron a sesiones de ejercicio y Técnica de escaneo 31 PMRS se describe en 2 días diferentes dentro de 1 semana para evaluar la técnica reproducibilidad (Figura 6a). Los estudios realizados en voluntari…

Discussion

Este documento describe un protocolo estándar para ³¹ PMRS examen que permite la medición de serie y no invasiva in vivo de la función mitocondrial del músculo esquelético. El protocolo tiene un atractivo considerable cuando se considera la amplitud de las investigaciones dirigidas a la creciente carga de síndrome metabólico y su morbilidad y mortalidad resultante. Este protocolo ³¹ PMRS requiere una cantidad mínima de tiempo escáner y puede ser incorporado en las investigaciones …

Materials

1.5 T MR Scanner	Siemens		manufacturer will not affect results
10 cm 31P transmit-receive coil, 1.5T compatible	PulseTeq		manufacturer will not affect results
3 fl oz Baby Oil	Johnson & Johnson		manufacturer will not affect results
Foam triangle cushion (Knee)	Siemens		manufacturer will not affect results
(3) plastic buckle resistive straps; table to table	Siemens		manufacturer will not affect results
(1) plastic buckle resistive strap; self-connecting	Siemens