Microscopie électronique à balayage (MEB) Protocoles pour Problematic plantes, Oomycètes et échantillons Fungal
Summary
Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.
Abstract
Les problèmes courants dans le traitement d'échantillons biologiques pour des observations au microscope électronique à balayage (MEB) comprennent l'effondrement des cellules, le traitement des échantillons de micro-environnements humides et la destruction des cellules. Utilisation de jeunes tissus floraux, des kystes oomycètes, et les spores de champignons (Agaricales) à titre d'exemples, des protocoles spécifiques pour traiter les échantillons délicats sont décrits ici qui surmontent certains des principaux défis dans le traitement de l'échantillon pour la capture d'image sous la SEM.
méristèmes floraux fixes avec la FAA (Formol-Acetic-alcool) et traitées avec le Point Sèche critique (DPC) n'affichait effondrés parois cellulaires ou des organes déformés. Ces résultats sont essentiels pour la reconstruction du développement floral. Un traitement à base de CPD-même des échantillons de micro – environnements humides, tels que les kystes de oomycètes glutaraldéhyde fixe, est optimal pour tester la croissance différentielle des caractéristiques de diagnostic (par exemple, les épines de kyste) sur différents types de substrates. Destruction des infirmières cellules attachées aux spores de champignons a été évitée après la réhydratation, la déshydratation et le traitement de DPC, une étape importante pour d'autres études fonctionnelles de ces cellules.
Les protocoles détaillés ici représentent à faible coût et des alternatives rapides pour l'acquisition d'images de bonne qualité pour reconstituer les processus de croissance et d'étudier les caractéristiques de diagnostic.
Introduction
En biologie, l'utilisation de la microscopie électronique à balayage (MEB) a été étendue à l' étude de l' évolution structurelle, la morphologie comparée, le développement des organes, et la caractérisation des populations ou des espèces 1. Avec sa vue en deux dimensions des structures microscopiques, des domaines tels que la micromorphologie et Systématique profité de SEM avance technique depuis la seconde moitié du 20 e siècle. Par exemple, l'introduction de la méthode de revêtement par pulvérisation cathodique dans les années 1970 a fait des observations possibles de matériaux fragiles tels que les sommets et les fleurs pousses amélioration de l'imagerie des tissus non conducteurs 2, 3. SEM utilise des électrons éjectés de la surface de l'échantillon pour reproduire la topographie dans un environnement sous vide poussé 4.
Les études portant sur SEM se concentrent à la fois l'inférence de caractères structurels et la reconstruction de growth processus. De nouveaux personnages structurels pertinents à la taxonomie et la systématique d'un large éventail d'organismes ont été découverts à partir d'observations MEB. Par exemple, les caractéristiques des plantes utilisées pour le diagnostic des espèces ou des classifications supraspécifiques, telles que les fosses ornées de bois 5, la stigmatisation de la diversité 6, nectaire et floral morphologie 7, 8, les détails de trichomes 9, et les grains de pollen 10, 11, ne peut pas être correctement visualisés sans SEM. Observations réussies avec SEM classique ont également été obtenus pour les organismes fixés au formol de longue date 12 et herbarium de spécimens végétaux 13.
D'autre part, les études de la reconstruction des processus de croissance à l' aide de SEM impliquent un large éventail de sujets, tels que le développement des organes 14, infections induites par les bactéries 15, plante racine physiologie 16, les mécanismes de fixation hôte-parasite 17, 18, les effets de la drogue sur les parasites 19, mycoparasitisme et antibiose 20, 21, la croissance malformation 22, développement comparative des individus sauvages et mutantes 23 et cycle de vie 24. Bien que les microscopes électroniques à balayage environnemental (ESEM) 25 peuvent avoir des avantages importants pour l'observation d'échantillons biologiques humides dans les processus de croissance, la matière délicate peut encore être compromise même en condition de faible vide de l'ESEM), et doivent être traitées de manière adéquate pour éviter la perte l'observation morphologique de valeur.
Dans cet article, un examen des protocoles spécifiques pour l'observation SEM de trois difftypes érents d'échantillons est présenté: méristèmes floraux, oomycètes (Saprolegnia) et matériel fongique. Ces protocoles compilent l'expérience de nos études antérieures basées sur SEM 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, où les difficultés spécifiques et des solutions alternatives ont été trouvées. Dans le cas de l' usine de développement comparatif et des études structurales, l'utilisation de SEM a commencé dans les années 1970 34, 35, et depuis lors, les chercheurs ont découvert que certaines caractéristiques florales sont plus labile que pensait auparavant 36. Reconstruction du développement floral implique la capture de toutes les étapes entre les jeunes méristèmes floraux et anthèse. Pour atteindre cet objectif, il est essential que la topographie de l'échantillon et l'intégrité de la paroi cellulaire ne sont pas compromises après la fixation et la déshydratation subséquente. Les jeunes méristèmes floraux sont particulièrement vulnérables à la paroi cellulaire effondrement (figures 1a, 1b). De même, les structures délicates telles que nectaires, pétales, stigmas et sporanges exigent des protocoles efficaces et undamaging. Cette revue résume un protocole optimal pour garder les jeunes et délicats tissus intacts pour l'imagerie SEM.
Dans le cas des oomycètes (straménopiles) , un des groupes les plus divers et les plus répandues de parasites, avec des hôtes allant de microbes et de plantes pour les invertébrés et les vertébrés 37 – il y a des spores qui se développent et se développent dans un environnement humide. Cette condition représente un défi pour l'observation SEM parce que les spores ont besoin d'un substrat adéquat ne convient pas pour les protocoles SEM standard. Parmi les oomycètes, les espèces de Saprolegnia sont particulièrement intéressants parce qu'ils can provoquer de fortes réductions aquacultures, les pêcheries et les populations d' amphibiens 38. Caractéristiques micromorphologiques, telles que les épines crochues de kystes, ont été trouvés pour être utile pour identifier les espèces de Saprolegnia, ce qui est fondamental d'établir des contrôles d'infection et des traitements potentiels 39. Ici, il y a un protocole expérimental pour comparer les modèles de la croissance de la colonne vertébrale de kystes sur différents substrats et de manipuler l'échantillon critique sèche point (CPD) la préparation et l'observation SEM subséquente.
Dans un troisième cas, il y a des résultats intéressants qui sont venus après une inspection des spores de champignons Phellorinia herculanea f. f stellata. nova (Agaricales) 31. Ensemble avec les spores, un groupe de cellules maternelles inattendues a été identifié dans le cadre du SEM. Avec les protocoles traditionnels précédents et des matières non traitées, les cellules nourricières sont venus OÜt complètement effondré (figure 1c). D' autres inférences sur des tissus particuliers associés aux spores peuvent être faites avec les modifications simples mais cruciales pour les approches standard décrites ici (Figure 1d).
Dans cette revue, il existe des protocoles SEM détaillées qui peuvent être utilisés pour faire face aux différents problèmes liés à l'observation SEM chez les angiospermes, oomycètes et Agaricales, tels que l'effondrement de la cellule et le rétrécissement du tissu méristématique, une croissance non optimale des épines de kystes, et la destruction des tissus éphémères, respectivement.
Figure 1: Comparaison des échantillons traités sans (a, c) et (b, d) le protocole FAA-éthanol-CPD. (A – b) Les boutons floraux de Anacyclus clavatus, mi-développement. Bud traité avec le tétroxyde d' osmium 46 </ sup> (a) et le bourgeon traité avec le protocole FAA-CPD (b). (C – d) les cellules de l' infirmière avec des spores de Phellorinia herculanea f. stellata. On sèche les échantillons sans aucun traitement (c) et le protocole décrit ici pour Agaricales (d). Spores en orange. Échelles: (ab) 100 um, (cd) 50 um. Les photos ont été prises par Y. Ruiz-León. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Protocol
Representative Results
Discussion
En ce qui concerne les protocoles SEM standard, les procédures présentées ici sont relativement rapide, facile à suivre, et les méthodes à faible coût. En fonction de la quantité d'échantillons et de la facilité de traitement, il faut compter de quatre à cinq jours pour obtenir des images de bonne qualité. Y compris les mesures de sécurité adéquates pour la CPD et le fonctionnement SEM, les procédures sont faciles à manipuler. Une attention particulière doit être prise avec de la formaline et le g…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce projet a été financé par Horizon 2020 du programme de recherche et d'innovation de l'Union européenne en vertu de la convention de subvention n ° 634429. Cette publication reflète uniquement les opinions de l'auteur, et la Commission européenne ne peut pas être tenu pour responsable de l'usage qui pourrait être fait des informations qui s'y trouvent. Nous reconnaissons également la contribution financière faite par le Real Jardín Botánico, CSIC. SR est reconnaissant à l'Union européenne [ITN-SAPRO-238550] pour le soutien de ses recherches dans le Saprolegnia. Nous tenons également à remercier Francisco Calonge pour bien vouloir fournir les images de herculanea Phellorinia et B. Pueyo pour le traitement des échantillons (figure 5). Toutes les images ont été prises par le service SEM au Real Jardín Botánico-CSIC à Madrid.
Materials
| Acetic acid | No specific supplier | Skin irritation, eye irritation | |
| aluminium stubs | Ted Pella, Inc. | 16221 | www.tedpella.com |
| Centrifuge tubes | No specific supplier | ||
| Critical Point Dryer | Polaron Quatum Technologies | CPD7501 | |
| D (+) Glucose | Merck | 1,083,421,000 | |
| Double sided sellotape | No specific supplier | ||
| Ethanol absolute | No specific supplier. | Flammable | |
| European bacteriological agar | Conda | 1800.00 | www.condalab.com |
| Filter paper | No specific supplier | ||
| Forceps | No specific supplier | ||
| Formalin 4% | No specific supplier. | Harmful, acute toxicity, skin sensitisation, carcinogenicity. Flammable | |
| Glass cover slips | No specific supplier | ||
| Glass hermetic container | No specific supplier | ||
| Glutaraldehyde 25% DC 253857.1611 (L) | Dismadel S.L. | 3336 | www.dismadel.com |
| Mycological peptone | Conda | 1922.00 | www.condalab.com |
| needles | No specific supplier | ||
| Petri dishes | No specific supplier | ||
| Plastic containers | No specific supplier | ||
| Sample holder with lid for the critical point dryer | Ted Pella, Inc. | 4591 | www.tedpella.com |
| scalpels | No specific supplier | ||
| Scanning Electron Microscope | Hitachi | S3000N | |
| Software for SEM | |||
| Solution A: NaH2PO4 | |||
| Solution B: Na2HPO4 | |||
| Specimen holders | No specific supplier | ||
| Sputter coater | Balzers | SCD 004 | |
| Stereomicroscope | No specific supplier | ||
| Transmission Electron Microscope (TEM) grids | Electron Microscopy Sciences | G200 (Square Mesh) | www.emsdiassum.com |
| Tweezers | No specific supplier |
Referenzen
- Endress, P. K., Baas, P., Gregory, M. Systematic plant morphology and anatomy: 50 years of progress. Taxon. 49 (3), 401-434 (2000).
- Falk, R. H., Gifford, E. M., Cutter, E. G. Scanning electron microscopy of developing plant organs. Science. 168 (3938), 1471-1474 (1970).
- Damblon, F. Sputtering, a new method of coating pollen grains in scanning electron microscopy. Grana. 15 (3), 137-144 (1975).
- Everhart, T. E., Thornley, R. F. M. Wide-band detector for micro-microampere low-energy electron currents. J. Sci. Instrum. 37 (7), 37246-37248 (1960).
- Collins, S. P., et al. Advantages of environmental scanning electron microscopy in studies of microorganisms. Microsc. Res. Techniq. 25 (5-6), 398-405 (1993).
- Fannes, W., Vanhove, M. P. M., Huyse, T., Paladini, G. A scanning electron microscope technique for studying the sclerites of Cichlidogyrus. Parasitol. Res. 114 (5), 2031-2034 (2015).
- Erbar, C., Leins, P. Portioned pollen release and the syndromes of secondary pollen presentation in the Campanulales-Asterales complex. Flora. 190 (4), 323-338 (1995).
- Jansen, S., Smets, E., Baas, P. Vestures in woody plants: a review. IAWA Journal. 19 (4), 347-382 (1998).
- Bortolin Costa, M. F., et al. Stigma diversity in tropical legumes with considerations on stigma classification. Bot. Rev. 80 (1), 1-29 (2014).
- Almeida, O. J. G., Cota-Sánchez, J. H., Paoli, A. A. S. The systematic significance of floral morphology, nectaries, and nectar concentration in epiphytic cacti of tribes Hylocereeae and Rhipsalideae (Cactaceae). Perspect. Plant Ecol. 15 (5), 255-268 (2013).
- Konarska, A. Comparison of the structure of floral nectaries in two Euonymus L. species (Celastraceae). Protoplasma. 252 (3), 901-910 (2015).
- Giuliani, C., Maleci Bini, L. Insight into the structure and chemistry of glandular trichomes of Labiatae, with emphasis on subfamily Lamioideae. Plant Syst. Evol. 276 (3-4), 199-208 (2008).
- Li, K., Zheng, B., Wang, Y., Zhou, L. L.Breeding system and pollination biology of Paeonia delavayi (Paeoniaceae), an endangered plant in the Southwest of China. Pak. J. Bot. 46 (5), 1631-1642 (2014).
- García, L., Rivero, M., Droppelmann, F. Descripción morfológica y viabilidad del polen de Nothofagus nervosa (Nothofagaceae). Bosque. 36 (3), 487-496 (2015).
- Prenner, G., Klitgaard, B. B. Towards unlocking the deep nodes of Leguminosae: floral development and morphology of the enigmatic Duparquetia orchidacea (Leguminosae, Caesalpinioideae). Am. J. Bot. 95 (11), 1349-1365 (2008).
- Ratnayake, K., Joyce, D. C., Webb, R. I. A convenient sample preparation protocol for scanning electron microscope examination of xylem-occluding bacterial biofilm on cut flowers and foliage. Sci. Hortic-Amsterdam. 140 (1), 12-18 (2012).
- Çolak, G., Celalettin Baykul, M., Gürler, R., Çatak, E., Caner, N. Investigation of the effects of aluminium stress on some macro and micro-nutrient contents of the seedlings of Lycopersicon esculentum Mill. by using scanning electron microscope. Pak. J. Bot. 46 (1), 147-160 (2014).
- Arafa, S. Z. Scanning electron microscope observations on the monogenean parasite Paraquadriacanthus nasalis from the nasal cavities of the freshwater fish Clarias gariepinus in Egypt with a note on some surface features of its microhabitat. Parasitol. Res. 110 (5), 1687-1693 (2012).
- Uppalapatia, S. R., Kerwinb, J. L., Fujitac, Y. Epifluorescence and scanning electron microscopy of host-pathogen interactions between Pythium porphyrae (Peronosporales, Oomycota)and Porphyra yezoensis (Bangiales, Rhodophyta). Bot. Mar. 44 (2), 139-145 (2001).
- Meaney, M., Haughey, S., Brennan, G. P., Fairweather, I. A scanning electron microscope study on the route of entry of clorsulon into the liver fluke, Fasciola hepatica. Parasitol. Res. 95 (2), 117-128 (2005).
- Sundarasekar, J., Sahgal, G., Subramaniam, S. Anti-candida activity by Hymenocallis littoralis extracts for opportunistic oral and genital infection Candida albicans. Bangladesh J. Pharmacol. 7 (3), 211-216 (2012).
- Benhamou, N., Rey, P., Picard, K., Tirilly, Y. Ultrastructural and cytochemical aspects of the interaction between the mycoparasite Pythium oligandrum and soilborne plant pathogens. Phytopathology. 89 (6), 506-517 (1999).
- Singh, A., et al. First evidence of putrescine involvement in mitigating the floral malformation in mangoes: A scanning electron microscope study. Protoplasma. 251 (5), 1255-1261 (2014).
- Xiang, C., et al. Fine mapping of a palea defective 1 (pd1), a locus associated with palea and stamen development in rice. Plant Cell Rep. 34 (12), 2151-2159 (2015).
- Mendoza, L., Hernandez, F., Ajello, L. Life cycle of the human and animal oomycete pathogen Pythium insidiosum. J. Clin. Microbiol. 31 (11), 2967-2973 (1993).
- Bello, M. A., Rudall, P. J., González, F., Fernández, J. L. Floral morphology and development in Aragoa (Plantaginaceae) andrelated members of the order Lamiales. Int. J. Plant Sci. 165 (5), 723-738 (2004).
- Bello, M. A., Hawkins, J. A., Rudall, P. J. Floral morphology and development in Quillajaceae and Surianaceae (Fabales), the species-poor relatives of Leguminosae and Polygalaceae. Ann. Bot. 100 (4), 1491-1505 (2007).
- Bello, M. A., Hawkins, J. A., Rudall, P. J. Floral ontogeny in Polygalaceae and its bearing on the homologies of keeled flowers in Fabales. Int. J. Plant Sci. 171 (5), 482-498 (2010).
- Bello, M. A., Alvarez, I., Torices, R., Fuertes-Aguilar, J. Floral development and evolution of capitulum structure in Anacyclus (Anthemideae, Asteraceae). Ann. Bot. 112 (8), 1597-1612 (2013).
- Bello, M. A., Martínez-Asperilla, A., Fuertes-Aguilar, J. Floral development of Lavatera trimestris and Malva hispanica reveals the nature of the epicalyx in the Malva generic alliance. Bot. J. Linn. Soc. 181 (1), 84-98 (2016).
- Calonge, F. D., Martínez, A. J., Falcó, I., Samper, L. E. Phellorinia herculanea f. stellata f. nova encontrada en España. Bol. Soc. Micol.Madrid. 35 (1), 65-70 (2011).
- Liu, Y., et al. Deciphering microbial landscapes of fish eggs to mitigate emerging diseases. ISME J. 8 (10), 2002-2014 (2014).
- Sandoval-Sierra, J. V., Diéguez-Uribeondo, J. A comprehensive protocol for improving the description of Saprolegniales (Oomycota): two practical examples (Saprolegnia aenigmatica sp. nov. and Saprolegnia racemosa sp. nov.). PLOS one. , (2015).
- Endress, P. K. Zur vergleichenden Entwicklungsmorphologie, Embryologie und Systematik bei Laurales. Bot. Jahrb. Syst. 92 (2), 331-428 (1972).
- Tucker, S. Floral development in Saururus cernuus (Saururaceae):1. Floral initiation and stamen development. Am. J. Bot. 62 (3), 993-1005 (1975).
- Endress, P. K., Matthews, M. L. Progress and problems in the assessment of flower morphology in higher-level systematics. Plant Syst. Evol. 298 (2), 257-276 (2012).
- Beakes, G. W., Glockling, S. L., Sekimoto, S. The evolutionary phylogeny of the oomycete "fungi". Protoplasma. 249 (1), 3-19 (2012).
- Romansic, J. M., et al. Effects of the pathogenic water mold Saprolegnia ferax on survival of amphibian larvae. Dis. Aquat. Organ. 83 (3), 187-193 (2009).
- van West, P. Saprolegnia parasitica, an oomycete pathogen with a fishy appetite: new challengues for an old problem. Mycologist. 20 (3), 99-104 (2006).
- Johansen, D. A. . Plant microtechnique. , (1940).
- Unestam, T. Studies on the crayfish plague fungus Aphanomyces astaci. Some factors affecting growth in vitro. Physiol. Plantarum. 18 (2), 483-505 (1965).
- Cerenius, L., Söderhäll, K. Repeated zoospore emergence from isolated spore cysts of Aphanomyces astaci. Exp. Mycol. 8 (4), 370-377 (1984).
- Diéguez-Uribeondo, J., Cerenius, L., Söderhäll, K. Repeated zoospore emergence in Saprolegnia parasitica. Mycol. Res. 98 (7), 810-815 (1994).
- Söderhäll, K., Svensson, E., Unestam, T. Chitinase and protease activities in germinating zoospore cysts of a parasitic fungus, Aphanomyces astaci, Oomycetes. Mycopathologia. 64 (1), 9-11 (1978).
- Echlin, P. . Handbook of sample preparation for scanning electron microscopy and X-Ray Microanalysis. , (2009).
- Osumi, M., et al. Preparation for observation of fine structure of biological specimens by high-resolution SEM. Microscopy. 32 (4), 321-330 (1983).
- Rezinciuc, S. . The Saprolegniales morpho-molecular puzzle: an insight into markers identifying specific and subspecific levels in main parasites. , (2013).
