Toepassing van een monocyt monolaag Gehalte aan Fcy receptor-gemedieerde fagocytose evalueren

Summary

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fcγ receptor (FcγR)-mediated phagocytosis.

Abstract

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fcγ receptor (FcγR)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express FcγRs (e.g., FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, and FcγRIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of FcγR-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate FcγRs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out FcγR-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo FcγR-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of FcγR-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

Introduction

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay originally developed to better predict blood transfusion outcomes in patients with auto- or alloantibodies to red blood cells (RBCs)^1-5. By assessing the effect of anti-RBC antibodies in mediating Fcγ receptor (FcγR)-mediated phagocytosis using this in vitro assay, it is possible to predict the clinical outcome in vivo. Indeed, the MMA has been used successfully to avoid immune destruction of antibody-bound RBCs, despite the transfusion of serologically incompatible blood⁵. The typical pre-transfusion procedure for compatibility testing, also termed crossmatching, involves serological methods that include typing the patient’s blood for ABO and Rh antigens and screening for the presence of anti-RBC antibodies in the patient⁶. Blood matched for ABO/Rh is selected, and if antibodies are present, an attempt to identify them is made so that blood for transfusion can be further selected to avoid these antigens. An ideal crossmatch result occurs when all donor blood is serologically compatible with the patient’s blood, which reduces the risk of post-transfusion hemolysis⁷. However, this system falls short for the small group of patients who have become alloimmunized upon repeated transfusion or pregnancy. These patients produce alloantibodies against specific RBC antigens. Some produce antibodies to antigens of very high frequency in the general population, and thus become progressively more difficult to crossmatch^8,9. Adding to the complexity, not all alloantibodies are clinically significant; in other words, the binding of an alloantibody to RBCs detected by a serology test does not necessarily result in hemolysis when antigen-positive, incompatible blood is transfused. The MMA was originally developed to assess the potential clinical significance of serologically incompatible blood in a transfusion setting^1-5.

Since extravascular hemolysis of antibody-bound RBCs is known to be mediated by the mononuclear phagocyte system, primary monocytes/macrophages are utilized in the development of diagnostic assays. The first assay to study the interaction of monocytes, RBCs, and antibodies was published in 1975, but the sub-optimal conditions used led only to rosette formation (the binding of RBCs to the periphery of the monocyte), and no phagocytosis was observed¹⁰. Significant modifications to the assay were made by several groups, leading to an assay for which the level of phagocytosis of alloantibody-bound RBCs could be correlated to the clinical outcome of hemolysis^1-5. Recently, the optimal storage conditions of clinical samples and further optimization of assay conditions were examined to enhance the utility of a clinical MMA crossmatch using autologous patient samples¹¹.

Three other diagnostic techniques have been employed in addition to the MMA in predicting transfusion outcomes: the ⁵¹Cr release test, the rosette test, and the chemiluminescence test (CLT). In the ⁵¹Cr release test, the patient is injected with ⁵¹Cr-labeled donor RBCs, and the half-life of the labeled RBCs is monitored and is predictive of post-transfusion survival or clearance^12,13. As this method uses radioactive materials, it is rarely performed anymore. The rosette test involves mixing and incubating monocytes with RBCs and quantifying the level of rosette formation (with no phagocytosis)¹⁴. The clinical significance of antibodies in vivo involves active phagocytosis by macrophages found in the spleen and/or the liver; thus, this method does not provide a relevant readout of phagocytosis. The CLT uses luminol to monitor the oxidative burst during monocyte phagocytosis of RBC, since luminol fluoresces blue when oxidized in the phagosome¹⁵. This method is good, but contamination by neutrophils can confound the readout. Parallel comparisons have been made to evaluate the sensitivity, practicality, and reproducibility of the four available methods, and both the CLT and MMA were ranked superior¹⁶. However, the CLT has been mainly utilized in assessing hemolytic disease of the fetus and newborn (HDFN), and the assay’s optimal pH of 8.0 might compromise the level of phagocytosis¹¹.

In addition to its diagnostic and clinical utility, the MMA has been modified for other research purposes. Indeed, the MMA can not only serve as a functional assay to address discrepancies between serology and biology, it has also been used to retrospectively investigate the cause of hemolysis after intravenous immunoglobulin (IVIG) therapy¹⁷. It has also been used to examine the structure-function of chemical inhibitors of FcγR-mediated phagocytosis^18-20 and to study the downstream signaling of FcγR-mediated phagocytosis²¹. In our laboratory, in addition to using a human MMA, we are developing a murine MMA using primary mouse peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and autologous RBCs. The rationale is to screen antibodies that can induce FcγR-mediated phagocytosis as an intermediate to developing an in vivo autoimmune hemolytic anemia (AIHA) mouse model (unpublished data). The various modifications focus on different aspects of the IgG antibody and FcγR interaction that induce phagocytosis.

Protocol

Het verkrijgen van goedkeuring voor het gebruik van menselijke monsters door de ethische raad van bestuur / institutionele review board, en het verkrijgen van ondertekend toestemming van alle menselijke donoren. De MMA kan ook worden uitgevoerd met PBMC muis op dezelfde wijze als de menselijke test na gebruik dierenethiek goedkeuring. De MMA maakt gebruik van aseptische weefselkweek technieken. OPMERKING: Zie figuur 1. LET OP: Hoewel we raden het gebruik van een level 2 biocontainment kabinet tijdens de test om aseptische techniek te behouden, als de methode is slechts een "short-term" cultuur-methode, is er niet echt genoeg tijd voor bacteriën om de test besmetten. Daarom, als een niveau 2 biocontainment kast niet bestaat, dan kopen alleen voor deze test, het assay kan worden uitgevoerd buiten een biocontainment kast, op een open bank. Het gebruik van een 37 ° C incubator met 5% CO 2 echter geen optie en moet worden gebruikt vooreen optimaal resultaat. 1. perifere mononucleaire Cell Isolation Verkrijgen van menselijk geheel bloed van een gezonde donor of een patiënt via venapunctie met behulp van vacutainers met zuur-citraat-dextrose (ACD) antistollingsmiddel (geel-top buizen). OPMERKING: Volbloed kunnen worden opgeslagen in ACD bij kamertemperatuur (18-22 ° C) gedurende 36 uur alvorens de volgende stap 11. Gewoonlijk 1-2 10 ml vacutainer buisjes volbloed voldoende voor de test. Verdun het geheel bloed 1: 1 v / v in warm compleet RPMI-medium (RPMI-1640 aangevuld met 10% foetaal runderserum, 20 mM HEPES en 0,01 mg / ml gentamicine). Isoleer perifere mononucleaire bloedcellen (PBMCs) uit het verdunde volbloed met behulp dichtheidsgradiënt centrifugatie, zoals aanbevolen door de fabrikant (zie lijst van materialen). Laag het verdunde bloed langzaam via dichtheidsgradiënt (verwarmd tot kamertemperatuur, 18-22 ° C). OPMERKING: Beperk de hoeveelheid mixing van de interface voor de optimale scheiding van het bloed door voorzichtig lagen bloed mengsel druppelsgewijze of met behulp van een pipet. Laat het bloed mengsel langzaam laag over de bovenkant van de dichtheidsgradiënt door het plaatsen van de pipet tip nabij de dichtheidsgradiënt en doordat het bloed mengsel afstromen van de buis langzaam. Afhankelijk van de schaal van experiment laag 10 ml bloed mengsel boven 3 ml dichtheidsgradiënt (in een 15 ml buis) of laag 35 ml bloed mengsel bovenop 15 ml dichtheidsgradiënt (in een 50-mL buis). Kenmerkend 10 ml volbloed levert 10 miljoen PBMC, met enkele donor tot donor variatie. Opmerking: Het is zeer belangrijk dat er geen menging van het bloed mengsel met de dichtheidsgradiënt. Het bloed mengsel moet laag over de dichtheidsgradiënt en langzaam omhoog totdat al het bloed bovenop de dichtheidsgradiënt. Centrifugeer de gelaagde mengsel bij 700 g gedurende 30 min zonder remmen. de centrifuged mengsel moet scheiden in 5 lagen (van boven naar beneden): plasma, buffy coat (met PBMCs), dichtheidsgradiënt materiaal, granulocyten, en RBC. Verwijder de meeste plasma en nauwkeurig ophalen van de inhoud bufferlaag (PBMC) in een nieuwe 15 ml buis met behulp van een Pasteur pipet en een zuigingsbol. Opmerking: Het verwijderen van de buffy coat-laag effectief gedaan door te zuigen aan de Pasteur pipet tijdens het uitvoeren van een draaiende beweging rond de buitenkant van de laag, met de punt van de pipet tegen de buis. Was de geïsoleerde PBMC drie keer pH 7,3 fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) door centrifugeren bij 350 g gedurende 10 min (vol remmen) tussen wasbeurten. Reconstitueer de PBMC pellet in volledig RPMI medium. Afhankelijk van de grootte van de pellet, 3-7 ml medium volstaat. Tel de PBMC met behulp van trypan blauw en een hemocytometer. Tellen alleen die cellen die niet zijn gekleurd door de trypan blauw. Reconstitute de PBMC's tot 1.750.000 cellen / ml in volledig RPMI medium. Seed 400 pi (700.000 cellen) in elk putje van een 8-kamer glijbaan. Incubeer de dia in een 37 ° C, volledig bevochtigde weefselcultuur incubator (aangevuld met 5% CO2) gedurende 1 uur om de monocyten / macrofagen te houden. 2. Pre-behandeling van Gekleefd Monocyten LET OP: Deze stap is alleen nodig als op zoek naar manieren om de fagocytose remmen of te verbeteren. Pre-treat gehandeld monocyten met enige drug (s) of de verbinding (en) van belang. Reconstitueer het geneesmiddel (en) of ander testmateriaal om de gewenste concentratie met behulp volledig RPMI medium. Opmerking: Zo wordt 200 ug / ml IVIG doorgaans gebruikt om een ​​95-100% remming van fagocytose verkregen bij gebruik humane monocyten. Aspireren en gooi de supernatant die alle niet-hechtende cellen van de 8-kamer slide na de 1-uur incubatie (na stap 1,6). Vervang het met 400pl van een geneesmiddel of een andere behandeling en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C. Bij het opzuigen en het vervangen van oplossingen in de 8-kamer glijbaan, zorg ervoor dat de stroom van de vloeistoffen te controleren, zodat zwak gehandeld cellen niet optillen. Ook werken met slechts 2-3 lege putjes tegelijk voorkomen en drogen van de putjes. LET OP: Typisch wordt elke behandeling uitgevoerd in technische drievoud. 3. opsonisatie van R2 R2 Red Blood Cells OPMERKING: De R 2 R 2 hier gebruikt worden verkregen uit de bloedinzamelingscentrum (Canadese Blood Services), maar ze zijn ook commercieel verkrijgbaar. Opsonized R 2 R 2 RBC's worden gebruikt als een positieve controle voor FcyR-gemedieerde fagocytose. Naïve R 2 R 2 moeten tot 1 maand bewaard in Alsever's oplossing (verlengen houdbaarheid) bij 4 ° C. Alsever De oplossing wordt bereid in-house en samengesteld uit 0,8% W / v trinatriumcitraat (dihydraat), 1,9% w / v glucose, 0,42% w / v natriumchloride en 0,05% w / v citroenzuur (monohydraat). Als R 2 R 2 cellen niet beschikbaar zijn, andere Rh-fenotype cellen, zoals R 1 R 2, R 1 R 1, R 1 R, R of R 2, kan worden gebruikt. Wash R 2 R 2 (CDE / CDE) rode bloedcellen in PBS totaal driemaal met gebruikmaking van centrifugatie bij 350 xg gedurende 5 minuten elk. Opmerking: Het aantal RBC's nodig afhankelijk van de experimentele groot en terug berekend. Was altijd een overmaat RBCs, aangezien RBC bouwen na elke wasbeurt door lysis of tijdens het verwijderen van supernatant. Bijvoorbeeld, in een experiment met 5 behandelingen en 2 controles, uitgevoerd in triplo technische, er in totaal 21 putjes. 21 putjes met 400 ul / putje van 1,25% RBC mengsel blijkt dat 105 pi gepakte, opsonized RBC nodig. 200 pi van RBC moet aanvankelijk worden gewassen en 150 & #181; L moeten worden opsonized om ervoor te zorgen dat er een voldoende hoeveelheid rode bloedcellen voor de fagocytose stap. Opsoniseren het gewassen R 2 R 2 pellet met 1: 1 v / v polyklonale anti-D antilichamen uit humaan serum en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C met periodiek mengen. OPMERKING: Indien polyklonale anti-D-antilichamen beschikbaar zijn, is het mogelijk om monoklonale anti-D antilichamen, die commercieel verkrijgbaar zijn, of anti-D dat gewoonlijk wordt gebruikt voor Rh immuun profylaxe, die kunnen worden verkregen bij bloedbanken of transfusie gebruiken diensten. Optimalisatie tests moeten worden uitgevoerd in het begin, bij het opzetten van de test, en wanneer wordt overgeschakeld veel-un getitreerd polyklonale antilichamen of over te schakelen naar een monoklonaal antilichaam. Dit is de optimale concentratie of het volume van anti-D vereist voor antiglobulinetest (IAT) gevolge van tussen 3+ en 4+ en fagocytose gevolg van tussen 70-90 gefagocyteerde erytrocyten per 100 monocyten geteld identificeren. Was de opsoniserend R 2 R 2 in totaal drie keer in PBS middels centrifugatie bij 350 xg gedurende 5 minuten elk. OPMERKING: Succesvolle opsonisatie van R 2 R 2 kan worden bevestigd door het uitvoeren van een indirecte IAT. Kort samengevat worden secundaire polyklonaal anti-humane antilichamen toegevoegd aan primaire opsoniserende antilichamen binden aan RBC oppervlakken, en het versterkte signaal in de vorm van hemagglutinatie worden waargenomen. Een gedetailleerd fabrikant protocol is te vinden in de aanvullende materialen bestand. Reconstitueer het gewassen R 2 R 2 pellet tot 1,25% v / v behulp volledig RPMI medium. OPMERKING: Excess geopsoniseerde R 2 R 2 kunnen voor tot een week opgeslagen in oplossing Alsever bij 4 ° C. 4. Fc Receptor-gemedieerde fagocytose Zuig het geneesmiddel of medium supernatant van de 8-kamer glijbaan en voeg 400 ul van 1,25% v / v R 2 R 2 mengsel. Incubeer bij 37 ° C gedurende 2 uur. achteruiter 2 uur incubatie, verwijder de kamers met behulp van adapters van de fabrikant. Dep het overtollige R2 R2 op een papieren handdoek. Zorg ervoor dat de dia niet uitdroogt. Vul een 100 ml bekerglas met PBS. Onderdompelen en was de schuif door langzaam de slede heen en weer (ongeveer 30-40 slagen) het merendeel van de niet-gefagocyteerd R 2 R 2 verwijderen. Verwijder de dia uit de PBS. Dep het overtollige PBS met behulp van een papieren handdoek of een tissue en air-droog de glijbaan. Bevestig de lucht gedroogd slide in 100% methanol gedurende 45 s. Dan, air-droog de vaste glijbaan. OPMERKING: slides kunnen worden gefixeerd met een andere methode die meer geschikt voor stroomafwaartse kleuring, zoals de Grünwald-Giemsa-kleuring 21 of Wright-Giemsa-kleuring 22. Monteer de dia met behulp van een in-house gemaakt Elvanol montage medium (of een ander in de handel verkrijgbaar montage gemiddeld) en voeg dekglaasjes. OPMERKING: Elvanol fixeermiddel bestaat uit 15% w / v polyvinyl alcohol hars en 30% v / v glycerol in PBS. Het mengsel wordt verhit totdat de hars is opgelost en de glycerine is homogeen gemengd. Deze kan worden vervangen door andere commercieel verkrijgbare fixeermiddel. Laat de mount nacht drogen voordat kwantificering. 5. Kwantificering van fagocytose Met behulp van een fasecontrastmicroscoop en een 40X objectief handmatig de hoeveelheid fagocytische gebeurtenissen gekwantificeerd door het tellen van minimaal 200 monocyten en het aantal gefagocyteerd R 2 R 2 binnen deze monocyten. Laat een teller in elke hand gelijktijdig het aantal monocyten en het aantal gefagocyteerd R 2 R 2 kwantificeren. Verkrijgen van de gemiddelde fagocytose index van het aantal gefagocyteerd R 2 R 2 te delen door het aantal monocyten en vermenigvuldigen met 100. Express de gegevens als de gemiddelde (gemiddelde fagocytische index) ± de standaardfout van het gemiddelde (SEM). </li>

Representative Results

Door de cruciale stappen in figuur 1 en de hierboven beschreven procedure, kan de MMA reproduceerbaar uitgevoerd. IVIG werd als voorbeeld voor de remming van fagocytose in figuur 2. IVIG is bekend te binden en blokkeren de Fc receptoren, waardoor de stroomafwaartse resultaat van fagocytose remmen. Door het titreren van de hoeveelheid IVIG toegepast, wordt een dosisafhankelijke remming waargenomen, waarbij concentraties boven 200 pg / ml resulteerde in bijna 100% remming en concentraties lager dan 0,5 ug / ml remden helemaal (figuur 2A). Wanneer de fagocytische indices getransformeerd en genormaliseerd op R 2 R 2 positieve controle als 0% remming, een inhibitie kromme met een IC50 van 3 ug / ml kan worden vastgesteld (Figuur 2B). Naast het uitvoeren van de test consequent, quantificatie van de test kan soms moeilijk zijn. Figuur 3 is een verzameling van fase-contrast microscopie beelden van verschillende MMA slides. Met microscopie ervaring kan men een monocyt van een verontreinigende RBC (figuur 3D), of een vacuole van een gefagocyteerde RBC (figuur 3B) onderscheiden. Dichte clusters van cellen en / of vuil moeten tijdens kwantificering (Figuren 3E en F) worden vermeden. Ook moet men vermijden van overmatig opsoniserende R 2 R 2 RBC, die tot verhoogde fagocytose de monocyt interieur overcrowds en interfereert met nauwkeurige kwantificering (Figuur 3C). Figuur 1. Schematische weergave van het MMA. Een stap-voor-stap afbeelding van de cruciale stappen in het MMA: isoleren PBMC uit volbloed, voeden de aangehechte monocytes met geopsoniseerde R 2 R 2, en wassen van de kamer schuift. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2. Intraveneuze IgG (IVIG) remt in vitro fagocytose met het MMA. IVIG is bekend fagocytose remmen en wordt gebruikt als een remming controle in het menselijk MMA. (A) Titratie van IVIG op een dosis-afhankelijke remming van fagocytose in vergelijking met de onbehandelde R 2 R 2 controle. De resultaten tonen het gemiddelde ± de standaardfout van het gemiddelde (SEM) van n = 3 experimenten. De statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van de Student t-test: ** P≤0.01 en *** p ≤ 0,001. (B) Remming curve van IVIG met een IC 50 of 3 ug / ml (stippellijn). De resultaten tonen gegevens genormaliseerd met onbehandelde R 2 R 2 (0% remming); gemiddelde ± SEM van n = 3 experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3. Fase-contrast microscopie beelden van het monster dia's onder 40x vergroting. (A) De perfecte slede waarin de monocyten gefagocyteerd 1-2 R 2 R 2 gemiddeld (zwarte pijlen met een onderscheidende halogloed), met zeer weinig contaminerende, un-gefagocyteerde R 2 R 2 op de achtergrond (witte pijlen). (B) Zoals in deze dia, monocyten soms vergrote vacuolen (witte pijlen), die sterk op gefagocyteerde R 2 R 2 kan zijn. (C </ strong>) Wanneer R2 R2 zijn geweest over-opsonized, meer dan 4-5 gefagocyteerd R2 R2 per monocyten (zwarte pijlen) maken nauwkeurig tellen moeilijk, omdat de R2 R2 zijn druk in de monocyten en duidelijke cel grenzen niet kunnen worden onderscheiden. (D) Onvoldoende wassen van de dia leidt tot overvloedige R2 R2 contaminatie (witte pijlen), die verward gehandeld RBC zou kunnen zijn. (E) Soms, monocyten en verontreinigende RBC's kunnen clusters. Clusters geven ook bacteriële besmetting, moet worden voorkomen. (F) Monocyten kunnen grotere aggregaten, die in te kwantificeren vermeden vormen. Het gebruik van willekeurige selectie van de velden te bekijken, paneel A is wat wordt meestal waargenomen als de MMA goed is uitgevoerd. Schaal bar is 20 micrometer. Klik hier alsjeblieftvoor een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

MMA is een bewerkelijke techniek die expertise in zowel weefselkweek microscopie vereist. Er zijn een aantal kritische stappen om succes te garanderen: 1) generatie van de monocyten monolaag; 2) opsonisatie van de rode bloedcellen, en 3) manuele kwantificeren. De monocyt monolaag niet sterk hechten aan de kamer dia, zodat fysiologische pH moet gedurende de test ¹¹ worden gehandhaafd en een voldoende aantal PBMCs worden gezaaid. Krachtig pipetteren, waarbij de aangehechte cellen kunnen verstoren, worden vermeden. Een benadering is altijd verwijderen en oplossingen toevoegen van dezelfde hoek van de kamer en dat de beweging langzaam en gestaag. Ook tijdens de laatste wasstap om het overtollige RBC's te verwijderen, de beweging moet langzaam en gestaag zijn. Hierdoor minimale verstoring van de monolaag terwijl het merendeel van de niet-gefagocyteerd RBC's te verwijderen. Onvoldoende wassen zal leiden tot een hoge achtergrond van verontreinigende RBC, die handmatig qua maaktntification moeilijk. Ten tweede moet de R ₂ R ₂ RBCs voldoende opsonized gemiddeld fagocytische index van 80-120 voor fagocytose controle te verkrijgen. Deze fagocytische gewenste bereik een evenwicht tussen gemak tellen (bijvoorbeeld monocyten meer dan 5 fagocytose RBC's zijn moeilijk nauwkeurig kwantificeren) en behouden van een voldoende hoeveelheid fagocytose voor statistische analyse. De mate van opsonisatie kan worden bevestigd door een IAT, en een lees- tussen 3+ tot 4+ nodig is. R ₂ R ₂ RBC's worden verwijderd wanneer er teveel lysis tijdens het wassen, wanneer het supernatans wordt donkerrood, of wanneer een significante afname van fagocytose waargenomen in experimenten vanwege de veroudering van de cellen opgeslagen. Ten slotte kan handmatig kwantificering met de microscoop lastig zijn, vooral bij het vergelijken van tellingen tussen laboratoriumpersoneel en tussen experimenten. Bij de behandeling van hetzelfde gebied op elk putje, of gewoon door het tellen van meer cellenEen consistentere telling kan worden verkregen. Side-by-side volgen en een ervaren technicus en het gebruik van een aangewezen aantal training slides aanbevolen.

Een belangrijke kritiek van de MMA is de subjectiviteit van de handleiding kwantificering stap. Echter, met een adequate opleiding, consistentie kan worden verkregen in de verschillende loketten. Een andere beperking is de intrinsieke donor tot donor verschillen in monocyten fagocytische capaciteiten en R ₂ R ₂ oppervlakteantigeen expressieniveaus, die een gegevensbron variatie bij de behandeling van menselijke monsters.

Andere alternatieve technieken beschikbaar voor de behandeling van FcyR-gemedieerde fagocytose. De meeste commerciële kits gebruiken fluorescerende uitgang fagocytose controleren (bijvoorbeeld bioparticles, pH-gevoelige fluorescentie-eiwit, of IgG-gemerkte fluorescerende latex bolletjes). Het gebruik van fluorescente productie aanbiedt objectiever kwantificeren, maar men moet ook conSider de beschikbaarheid, kosten en training van het gebruik van een fluorescentiemicroscoop of een flowcytometer, evenals de daaruit voortvloeiende afhankelijkheid van commercieel verkrijgbare kits.

Tenslotte kan deze test worden aangepast afhankelijk van de vraagstelling. Bijvoorbeeld bij het testen van remming van fagocytose, monocyten kan ofwel worden voorbehandeld of co-geïncubeerd met zowel middelen en geopsoniseerde RBCs (dwz een competitie assay). De stroomafwaartse signalering van antilichamen van verschillende subtypes, chimere antilichamen of recombinante constructen kunnen worden getest. Met recente vooruitgang in de ontwikkeling van een universeel antigeen-null bloed ²⁴ kan de MMA in eerste schermen van deze antigeen-null RBCs met diverse antilichamen worden gebruikt om te beoordelen of er inderdaad een verminderde werkzaamheid bij triggering fagocytose.

Materials

Acid citrate dextrose (ACD) vacutainers	BD	REF364606
RPMI 1640	Sigma	R8758
HEPES	Bioshop	HEP003.100
Fetal bovine serum	Multicell	080150
Gentamicin	Gibco	15710-64
Ficoll-Paque PLUS	GE	17-1440-03	https://www.gelifesciences.com/
Phosphate buffered saline	Sigma	D8537
8-chamber slides	Lab-Tek-ll	154534
R2R2 (cDE/cDE) red blood cells	Canadian Blood Services		Commercially available (e.g. http://www.bio-rad.com/en-ca/product/reagent-red-blood-cells)
Polyclonal anti-D from human serum	Gamma Biologics	DIN 02247724	Can be substituted with commercially available monoclonal anti-D or with Rh immune globulin
100% methanol	Caledon	6700-1-42
Polyvinyl alcohol resin	Sigma	P8136	Can be substituted with commercially available mount
UltraPure glycerine	Invitrogen	15514-011
Cover slips	VWR	48366 067
Novaclone anti-IgG	Immucorgamma	5461023	Optional for IAT (http://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/…/ucm081743.pdf)