Cell-gratuit Analyse d'intégrité de l'ADN dans des échantillons d'urine
Summary
A method for analyzing DNA integrity in the cell-free supernatant fraction of urine samples is proposed. The method is suitable for early detection of urological malignancies and has proven accurate for the early diagnosis of bladder cancer.
Abstract
Bien que la présence de l'ADN circulant exempt de cellules dans le plasma ou le sérum a été largement démontré être une source appropriée de biomarqueurs pour de nombreux types de cancer, peu d'études se sont concentrées sur l'utilisation potentielle de (ICU) un ADN acellulaire de l'urine. En partant de l'hypothèse que les cellules apoptotiques normaux produisent de l'ADN très fragmentée et que les cellules cancéreuses relargage plus de l'ADN, le rôle potentiel de l'intégrité de l'ADN ICU a été évaluée en tant que marqueur de diagnostic précoce capable de distinguer entre les patients atteints de la prostate ou le cancer de la vessie et les individus sains.
Une analyse de l' intégrité UCF ADN est proposée sur la base de quatre PCR quantitative en temps réel de quatre séquences de plus de 250 pb: c-MYC, BCAS1, HER2 et AR. Des séquences qui ont fréquemment une augmentation du nombre de copies d'ADN dans les cancers de la vessie et de la prostate ont été choisies pour l'analyse, mais le procédé est flexible, et ces gènes peuvent être substitués par d'autres gènes d'intele repos. L'utilité potentielle de UCF ADN comme une source de biomarqueurs a déjà été démontrée pour les tumeurs malignes urologiques, ouvrant ainsi la voie à d'autres études sur la caractérisation UCF ADN. Le test d'intégrité de l'ADN UCF a l'avantage d'être non-invasive, rapide et facile à réaliser, avec seulement quelques millilitres d'urine nécessaires pour effectuer l'analyse.
Introduction
acellulaire d'ADN peut être détectée dans le sang et l'urine en raison de la mort cellulaire par des mécanismes apoptotiques ou nécrotiques. ADN acellulaire du sang a été largement étudiée à des fins diagnostiques et pronostiques dans diverses maladies, notamment le cancer 1. Cependant, on connaît moins le rôle de (UCF) ADN libre-cellulaire urinaire. UCF ADN peut provenir de passage du sang à travers le système de filtration glomérulaire ou de cellules qui entrent directement en contact avec ce fluide corporel 2 (par exemple, des cellules urothéliales et des cellules de la prostate). L'utilisation d'ADN ICU comme source de marqueurs biologiques a été étudiée principalement pour le diagnostic précoce du rein, de la vessie et le cancer de la prostate en raison du pourcentage élevé de l' ICU ADN provenant directement à partir de cellules des voies urinaires 3,4.
On connaît peu UCF l'ADN et les meilleures méthodes pour isoler et caractériser. Compte tenu de l'hypothèse selon laquelle les cellules tumorales libèrent des fragments d'ADN plus longs que les cellules normales, l'évaluationl'intégrité de l' ADN acellulaire a été étudiée dans le but d'élucider l'origine de l' ADN dans la circulation sanguine 5. Certaines études ont démontré que l' intégrité de l' ADN acellulaire du sang représente un bon test de diagnostic pour plusieurs types de cancer 6, et la même hypothèse a été proposée par rapport à l' urine 7-9.
Cet article décrit une nouvelle méthode pour l'analyse de l'intégrité UCF ADN avec une application potentielle à la détection de la vessie et de la prostate. En particulier, l'intégrité de l' ICU fragments d' ADN de plus de 250 pb a été testé en 4 régions connues pour avoir un nombre accru de copies d'ADN dans des tumeurs solides, y compris de la prostate et le cancer de la vessie: c-myc (8q24.21), HER2 (17q12.1 ), BCAS1 (20q13.2) et AR (Xq12) 10-14. oncogènes spécifiques, plutôt que des séquences aléatoires, ont été choisis pour augmenter la probabilité de les trouver dans la fraction exempte de cellules de patients atteints de cancer. L'un des principaux avantages dece procédé est qu'il est flexible et que d'autres régions peuvent également être sélectionnés sur la base du type de tumeur et ses caractéristiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
UCF analyse de l'intégrité de l'ADN est une nouvelle méthode non invasive pour l'évaluation de l'intégrité de l'ADN dans l'urine. Il a été récemment proposé pour le diagnostic précoce de la vessie et de la prostate 9 cancers 7,8. Un certain nombre d'avantages et inconvénients du test d'intégrité UCF ADN sont discutés ici, ainsi que les perspectives d'avenir.
Le principal avantage de cette approche est qu'elle offre …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Gráinne Tierney and Silvia Bellissimo for their editorial assistance.
Materials
| QIAamp DNA Mini Kit |
Qiagen | 51304 | |
| iQ SYBR Green Supermix, 100 x 50 µl rxns, 2.5 ml (2 x 1.25 ml) | Biorad | 1708880 | |
| IDT custom DNA oligos | IDT | HPLC purification, 100nMole DNA oligo | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | Other spectrophotometric methods could also be used to quantify DNA | |
| Rotor-Gene 6000 | Corbett | Another Real Time PCR instrument could also be used | |
| microcentrifuge | |||
| one centrifuge for 50 ml tubes | |||
| incubator | |||
| -80°C freezer | |||
| -20°C freezer | |||
| 10 ul pipette | |||
| 20 ul pipette | |||
| 200 ul pipette | |||
| 1000 ul pipette | |||
| pipette tips (10;20;200;1000) | |||
| 1,5 ml tubes | |||
| 50ml tubes | |||
| 15 ml tubes | |||
| Rotor-Disc 72 Rotor | Corbett | 9018899 | |
| Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (250) | Qiagen | 981103 | |
| Collection Tubes (2 ml) | Qiagen | 19201 | |
| Buffer AL (264 ml) | Qiagen | 19075 | |
| Proteinase K (10ml) | Qiagen | 19133 |
Referenzen
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