지원되는 지질 이중층에 리간드 나노 클러스터의 배열
Summary
우리는 유체 지질 이중층에 둘러싸여 나노 단백질 패치 유리를 기능화하는 프로토콜을 제시한다. 이 기판은 첨단 광학 현미경과 호환 및 세포 부착 및 이동 연구를위한 플랫폼 역할을 할 것으로 예상된다.
Abstract
현재 세포 생물학 연구를위한 패시베이션 표면의 바다에서 접착 단백질 섬의 순서 배열을 만드는 상당한 관심이있다. 지난 몇 년 동안, 그것은 살아있는 세포가 그들에게 제시 분자의 생화학 적 특성뿐만 아니라 이러한 분자가 제시하는 방식뿐만 아니라, 응답하는 것이 점점 명백 해졌다. 많은 생물학 실험실에서 이제 표준 그러므로 단백질 마이크로 패턴입니다 생성하는 단계; 나노 패턴은 더 액세스 할 수 있습니다. 그러나, 세포 – 세포 상호 작용의 맥락에서, 패턴에 필요뿐만 아니라 단백질뿐만 아니라 지질 이중층이있다. 이러한 이중 proteo – 지질 패턴은 지금까지 쉽게 접근 할 수 없었다. 우리는 유리에 지원되는 단백질 나노 도트를 만들고 지원되는 지질 이중층 (SLB)로 간 점 공간을 백필하는 방법을 제안 할 수있는 손쉬운 방법을 제공합니다. 트레이서의 사진에서 형광 표백 지질이 포함 SLB, 우리는 이중층의 PL-상당한 나타냄을 입증메탄을 유동성. 형광 그룹과 단백질 점을 기능화하는 이미지 그들과 그들이 정기적 육각형 격자에 정렬 것을 보여주기 위해 우리를 할 수 있습니다. 일반적인 도트 크기가 약 800 ㎚이며 여기 입증 간격은 2 마이크론이다. 이들 기판은 세포 부착, 이동 및 메카 감지 연구를위한 유용한 플랫폼을 제공 할 것으로 예상된다.
Introduction
세포 유착은 세포 외 기질 또는 다른 셀에 그들의 상대에 결합 할 수있는 세포막에 존재하는 전문 세포 부착 분자 (CAM들) 단백질을 통해 일어난다. 접착 된 세포에 편재하는 인테그린과 카데 포함한 대부분의 접착 분자, 클러스터 (1)의 형태로 제공된다. 항원 제시 세포와 T 림프구 (T 세포)의 작용 (장갑차)이 두 셀 사이의 인터페이스에서 형성 수용체 클러스터의 중요성은 특히 현저한 설명을 제공한다 – 종종 면역 시냅스했다. cSMAC (큰 중앙 초분자 클러스터를 형성하도록 플랫폼 (2), (3, 4)에게 시그널링 역할을하고, 최종적으로 집중되는 T 세포 형태 마이크론 스케일 클러스터의 표면상의 APC, T 세포 수용체 (TCR도)와 제 접촉을 형성하면 )아가씨 = "외부 참조"> 5, 6, 7. 최근는 APC 측 것을 도시하고, TCR의 리간드는 또한 8 클러스터된다.
은 APC가 중요한 단백질 기능화 인공 표면에 의해 모방된다 T 세포 APC 상호 작용, 하이브리드 시스템의 배치의 상황에서, 시냅스 인터페이스 2, 3, 4, 5, 6, 7에 대한 이해를 전진 크게했다 . 이러한 맥락에서, 상기 타겟 셀의 하나 이상의 양상을 포착 APC 모방 표면을 설계하는 것이 매우 적합하다. 리간드가 지원되는 지질 이중층에 이식하는 경우 예를 들어, 그들은 이중층의 평면 확산은 APC 표면에 상황을 모방하고 동시에의 형성을 허용 할 수 있습니다cSMAC 6,7. 마찬가지로, APC의 클러스터는 중합체 9, 10, 11, 12, 13, 14의 바다 섬 리간드를 모방하여 생성되었다. 그러나 이러한 두 가지 기능은 지금까지 결합되지 않았다.
여기에서는 확산 지질과 지질 이중층으로 둘러싸인 항 CD3 (TCR의 복합체를 표적 항체)의 나노 도트를 생성하는 신규 한 기술을 설명한다. 이중층은 랭 뮤어 – 블로 젯 / 랭 뮤어 쉐퍼 기술 7, 15, 16을 이용하여 증착되고, 필요하다면, 특정 단백질로 작용 화 될 수있다 – 예를 들면, T 세포의 인테그린의 리간드 (ICAM1 불림). 또한, 항 CD3 단백질 도트를 기LD는 다른 항체 또는 CAM으로 대체 될 수있다. 우리는 T 세포 접착 연구를위한 플랫폼으로 향후 사용을 위해 단백질을 선택하고 있지만, 여기에 설명 된 전략은 어떤 단백질과도 DNA에 대해 적용 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
전술 한 프로토콜 내에서 중요한 단계는 지원 지질 이중층에 의해 단백질 나노 점 또는 점 주위 공간의 백 필러의 형성에 관련이있다. 단백질 나노 도트에 대한 제 1 임계 단계 비드 마스크의 제조 방법이다. 커버 슬라이드의 청소가 중요합니다. 슬라이드 중 하나, 또는 산소 플라즈마로 석영 큐벳을 청소 추천 된 세제를 청소해야합니다. 에탄올 또는 이소프로판올의 치료와 같은 다른 침지 세정 ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 휴대 전화 응용 프로그램에 대한 유익한 토론을 계속하기위한 로랑 Limozin, 피에르 딜라드와 아스트리드 월합니다. 우리는 또한 SEM 관찰 그의 도움을 PLANETE 클린 룸 시설에서 프레데릭 베두합니다. 이 작품은 부분적으로 허가 번호 307104 FP / 2007년부터 2013년까지 / ERC를 통해 유럽 연구위원회에 의해 투자되었다.
Materials
| Glass coverslips | Assistent, Karl Hecht KG | |
| Observation chamber | Home made | |
| Alkaline surfactant concentrate (Hellmanex) | Hella Analytics | 9-307-011-4-507 |
| Ultra-sonicator | ThermoFisher | |
| Desiccator | Labbox | |
| Crystallizer | Shott | |
| Neutravidine | Thermo Fischer Scientifique | 84607 |
| PBS | Sigma-aldrich | P3813 |
| Water MQ | ELGA, Veolia France | |
| Silica beads | Corpuscular Inc | 147114-10 |
| APTES | Sigma-aldrich | A3648 |
| BSA-Biotin | Sigma-aldrich | A8549 |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C |
| Dansyl-PE | Avanti Polar Lipids | 810330C |
| Chloroform | Sigma-aldrich | 650471 |
| Gastight syringe | Dominique Dustcher , France | 74453 |
| Film balance | NIMA | Medium |
| Microscope | Zeiss, Germany | TIRF-III system |
| Aluminium Target | Kurt J. Lesker Compagny, USA | |
| Radio Frequency Magnetron sputtering Système | modified SMC 600 tool by ALCATEL , France |
Referenzen
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