Мы представляем протокол для функционализации стекла с нанометровыми белковыми пятнами, окруженными жидкостью липидного бислой. Эти субстраты совместимы с современной оптической микроскопии и, как ожидается, служить в качестве платформы для клеточной адгезии и миграции исследований.
В настоящее время существует значительный интерес к созданию упорядоченных массивов адгезивных белков островков в море пассивирован- поверхности для биологических исследований клеток. В последние года она становится все более очевидной, что живые клетки реагируют не только на биохимическую природу молекул, представленных им, но и к тому, как представлены этим молекулам. Создание белковых микро-модели, таким образом, в настоящее время стандартом во многих биологических лабораториях; нано-структура также является более доступной. Однако, в контексте межклеточных взаимодействий, существует необходимость в шаблон не только белки, но и липидные двухслойные. Такой двойной Proteo-липидной структурирование до сих пор не было легко доступны. Мы предлагаем легкое техника для создания белковых нано-точек, нанесенных на стекле и предложить способ засыпки между точечным пространством с поддерживаемым липидным бислой (SLB). С фото-отбеливание трассера флуоресцентные липиды включены в БВУ, мы показали, что бислой обладает значительным в-плана текучесть. Функционализующих белковые точки флуоресцентных групп позволяют им изображение и показать, что они упорядочены в правильной гексагональной решетке. Типичный размер точек составляет около 800 нм, а расстояние между продемонстрирована здесь составляет 2 мкм. Эти подложки, как ожидается, чтобы служить в качестве полезных платформ для клеточной адгезии, миграции и исследований механо-зондирования.
Адгезия клеток происходит через специализированные молекул клеточной адгезии (АМСГ), белки, присутствующие на клеточной мембране, которые способны связываться с их аналогом на внеклеточном матриксе или на другую клетку. На прилипших клетки, большинство молекул адгезии , включая повсеместные интегриный и кадгерин, находятся в виде кластеров 1. Взаимодействие Т-лимфоцитов (Т-клетки) с антиген-представляющими клетками (АРС) обеспечивает особенно яркой иллюстрацией важности кластеров рецепторов, сформированных на границе раздела между двумя клетками – часто называют иммунологический синапс. При формировании первого контакта с рецепторами клеток АРС, Т (TCR) на поверхности масштабных кластеров формы клеток микронного Т , которые служат в качестве сигнальных платформ 2, 3, 4, и, в конечном счете централизованных , чтобы сформировать больший центральный надмолекулярный кластер (cSMAC )деваха = "Xref"> 5, 6, 7. В последнее время было показано , что на стороне APC, лиганды рецептора Т – клеток, также сгруппированы 8.
В контексте Т – клеток-APC взаимодействия, развертывание гибридных систем, где АРС имитировало искусственную поверхность функционализированной с соответствующими белками, значительно продвинул наше понимание синаптического интерфейса 2, 3, 4, 5, 6, 7 , В этом контексте имеет большое значение для разработки APC мимические поверхностей, которые захватывают один или несколько аспектов клетки-мишени. Например, если лиганды привиты на поддерживаемых липидных бислоев, они могут диффундировать в плоскости бислоя, имитировать ситуацию на поверхности APC и в то же время позволяет формированиеcSMAC 6, 7. Аналогичным образом , кластеры на APC были имитировали путем создания островков лигандов в море полимеров 9, 10, 11, 12, 13, 14. Тем не менее, эти две функции до сих пор не были объединены.
Здесь мы описываем технику, чтобы создать новую нано-точек анти-CD3 (антитело, которое нацеливает комплекс TCR), окруженный липидный бислой с диффундирующими липидами. Бислой осаждают с помощью Ленгмюра-Блоджетт / Ленгмюра-Schaefer технику 7, 15, 16 и , если желательно, может быть функционализированный с определенным белком – например, лиганд клеточного интегрина Т ( так называемый ICAM – 1). Кроме того, анти-CD3 белка точек КоуLD быть заменен другим антителом или CAM. В то время как мы выбрали белки для дальнейшего использования в качестве платформы для исследований клеточной адгезии Т, стратегия подробно здесь может быть адаптирована для любого белка и даже ДНК.
Критические шаги в рамках протокола, описанном выше, связаны с образованием белковых нано-точек или задним заполнением пространства вокруг точек с помощью поддерживаемого липидного бислой. Первый важный шаг в отношении белкового нано-точка является подготовкой борта-маска. Чистка кр…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Лоран Limozin, Пьер Диллард и Астрид Валь для продолжения плодотворной дискуссии по поводу приложений сотовой связи. Мы также благодарим Фредерика Беду от PLANETE чистых помещений объекта за его помощь с наблюдениями SEM. Эта работа была частично финансируется Европейским исследовательским советом по грант № 307104 FP / 2007-2013 / ERC.
Glass coverslips | Assistent, Karl Hecht KG | |
Observation chamber | Home made | |
Alkaline surfactant concentrate (Hellmanex) | Hella Analytics | 9-307-011-4-507 |
Ultra-sonicator | ThermoFisher | |
Desiccator | Labbox | |
Crystallizer | Shott | |
Neutravidine | Thermo Fischer Scientifique | 84607 |
PBS | Sigma-aldrich | P3813 |
Water MQ | ELGA, Veolia France | |
Silica beads | Corpuscular Inc | 147114-10 |
APTES | Sigma-aldrich | A3648 |
BSA-Biotin | Sigma-aldrich | A8549 |
DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C |
Dansyl-PE | Avanti Polar Lipids | 810330C |
Chloroform | Sigma-aldrich | 650471 |
Gastight syringe | Dominique Dustcher , France | 74453 |
Film balance | NIMA | Medium |
Microscope | Zeiss, Germany | TIRF-III system |
Aluminium Target | Kurt J. Lesker Compagny, USA | |
Radio Frequency Magnetron sputtering Système | modified SMC 600 tool by ALCATEL , France |