Een Syngenische muismodel van gemetastaseerd niercelcarcinoom voor Kwantitatieve en Longitudinale Evaluatie van de preklinische therapieën

Summary

Implementatie van een orthotope model niercelcarcinoom in immunocompetente muizen levert de onderzoeker een klinisch relevante systeem gedefinieerd door de aanwezigheid van een primaire niertumor en longmetastasen in hetzelfde dier. Dit systeem kan worden gebruikt om een verscheidenheid aan behandelingen in vivo preklinisch testen.

Abstract

Niercelcarcinoom (RCC) van invloed op> 60.000 mensen in de Verenigde Staten elk jaar, en ~ 30% van de RCC patiënten hebben meerdere uitzaaiingen op het moment van de diagnose. Gemetastaseerd niercelcarcinoom (mRCC) is ongeneeslijk, met een mediane overleving van slechts 18 maanden. Immuun-interventies (bijvoorbeeld, interferon (IFN) en interleukine (IL) -2) induceren duurzame reacties in een fractie van mRCC patiënten en multikinaseremmer remmers (bijv sunitinib of sorafenib) of anti-VEGF-receptor monoklonale antilichamen (mAb) zijn grotendeels palliatieve, als complete remissies zijn zeldzaam. Dergelijke tekortkomingen in de huidige therapieën voor mRCC patiënten de reden voor de ontwikkeling van nieuwe behandelingsprotocollen. Een sleutelcomponent in de preklinische testen van nieuwe therapieën voor mRCC een geschikt diermodel. Gunstige eigenschappen dat het menselijk herhalen omvat een primaire niertumor, nier tumormetastasen en een intact immuunsysteem één therapie gedreven immunologische onderzoeken effector reacties en de vorming van tumor geïnduceerde immuno-onderdrukkende factoren. Dit rapport beschrijft een orthotope mRCC muismodel dat al deze functies heeft. We beschrijven een intrarenaal implantatietechniek met de muis renale adenocarcinoom cellijn Renca, gevolgd door de beoordeling van tumorgroei in de nier (primaire plaats) en de longen (metastatische lokalisatie).

Introduction

Niercelcarcinoom (RCC) is goed voor het merendeel van de kwaadaardige nier tumoren en ongeveer 3% van alle volwassen maligniteiten wereldwijd ^{1, 2.} Wegens gebrek aan symptomen, verkeerde diagnose en onvoldoende screeningsmethoden voor RCC, bijna 30% van de patiënten ten tijde van de diagnose te stellen met metastatische RCC (mRCC), met een extra 20-30% van de patiënten progressie naar een metastatische fase ^2. Deze gevallen leiden tot ~ 13.500 sterfgevallen per jaar ^{1, 3.} Hoewel vroege detectie en behandeling van primaire RCC is verbeterd, de snelheid van RCC-gerelateerde dood blijft toenemen, wat suggereert dat metastatische ziekte is grotendeels verantwoordelijk voor de sterfte ^3. Ontwikkeling van behandelingen bij RCC heeft geboekt in het afgelopen decennium met de ontdekking en de implementatie van gerichte therapieën en immuuntherapie. Helaas, progressievrije overleefdeal en totale overleving van gevorderde gevallen nog steeds ruim onder 2 jaar voor de meeste patiënten ^{4, 5, 6.} Deze statistieken rechtvaardigen de noodzaak voor verder onderzoek naar de identificatie en ontwikkeling van effectieve behandelingen voor RCC. Om adequaat te bevorderen therapeutische interventies voor mRCC worden translationeel relevante pre-klinische modellen van de ziekte voor het eerst nodig is.

Ontwikkeling van een relevante en consistente model om de menselijke conditie van geavanceerde RCC recapituleren moet een aantal belangrijke vragen: 1) Is het model anatomisch relevant; 2) Is de tumor vooruitgang vergelijkbaar met de humane pathologie; 3) Doe uitzaaiingen ontstaan ​​uit de primaire tumor; en 4) Kan de primaire en metastatische progressie van de tumor worden gevolgd in de tijd? Afhankelijk van het type behandeling onderzocht, muis RCC tumorcellijnen, humane RCC tumorcellijnen en humane RCC-patiënten afgeleide xenogvlotten kunnen in immunocompetente of immunodeficiënte muizen. Een gastheer met een intact en functioneel immuunsysteem nodig voor de studies die een aspect van immunotherapie, in het gebruik van de goed beschreven Renca cellijn afgeleid van een spontane renale adenocarcinoom van Balb / c muizen ^7. De meeste studies injecteren Renca-cellen subcutaan (sc), die een gemakkelijke maat lokale tumor vormt, of intraveneus (iv) in Balb / c muizen experimentele long "metastasen" ^{8, 9, 10, 11, 12} te produceren. Gebruik van een sc-geïmplanteerde Renca tumor model humane RCC heeft een aantal beperkingen, met inbegrip van onnauwkeurige innervatie van vasculatuur ¹³ verschillen in micro ^{14, 15,} en noch orgaanschade / tumor cellulaire communicatie ^{13, 16.} Bovendien zijn veel sc tumoren (in het bijzonder Renca) niet uitzaaien naar distale organen remmen van de studie van een gebeurtenis die een gemeenschappelijke klinische kenmerken ^17. MRCC te bestuderen, kunnen Renca-cellen worden iv geïnjecteerd om tumorlast te vestigen in de longen the zetel van uitzaaiingen in RCC patiënten. De iv injectie methode voor het inleiden uitgezaaide tumoren, maar staat niet toe dat het onderzoek naar hoe, wanneer of waarom de cellen zijn gemigreerd van de primaire orgel (dat wil zeggen, de nieren) naar de verre plaats. Een model met zowel primaire als metastatische ziekte duidelijk in hetzelfde dier is cruciaal voor de voortgang en de behandeling van gevorderde ziekte te bestuderen, vooral omdat metastasen typisch de oorzaak van mortaliteit bij deze patiënten.

Ons laboratorium heeft een muizenmodel van mRCC dat alle van de hierboven genoemde functies bevat ontwikkeld. Om pr vast te stellenimary, orthotope tumoren worden Renca cellen direct geïmplanteerd in de nier van de dieren door de doorzichtige peritoneum. Een kleine incisie in de linkerflank maakt visualisatie van de milt (als landmark) en de linker nier. Met een kleine naald maat worden Renca tumorcellen direct geïnjecteerd in de nier door het peritoneum van orthotope implantatie. Vergeleken met andere werkwijzen voor het implanteren Renca-cellen onder de niercapsule ¹⁸ deze wijze van implanteren zorgt voor een hogere doorvoersnelheid, aangezien het tamelijk non-invasieve, hoeft hechten vereisen, is een lage pijn klasse en tijdbesparende bij geoefend.

Dit goed gekarakteriseerd model leidt tot reproduceerbare primaire tumorbelasting (~ 99% opbrengst rate) in het geïnjecteerde nieren en metastatische tumor belasting in de longen. De belangrijkste voordelen van dit model zijn onder meer de syngene aard, waardoor voor immunotherapie onderzoeken; haar spontane metastasen, om te studeren eendvanced ziekte; en de orthotope implantatie, de anatomische invloed van ziekteprogressie en behandeling modelleren. Therapieën gericht op targeting RCC zouden veel baat hebben bij het gebruik van dit model tijdens de preklinische ontwikkeling.

Protocol

Het volgende protocol beschrijft een procedure voor het induceren van experimentele en controle op de groei van experimentele orthotope niertumoren en eventuele spontane metastasen. Alle volgende procedures worden gedaan in overeenstemming met de institutionele beleid en goedgekeurde procedures met betrekking tot het humane gebruik van proefdieren. 1. Onderhoud van cellijnen Handhaaf murine renale adenocarcinoom cellijn, Renca, Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium aangevuld met 10% foeta…

Representative Results

De succesvolle implantatie van Renca-cellen leidt tot de ontwikkeling van tumoren in de nier en metastase naar de longen van de muizen. Na de excisie van de tumor-dragende en de contralaterale nieren werden vochtige doekje gewicht (g) gemeten om de tumorbelasting basis van gewichtstoename (figuur 1) tonen. Renca tumoren kunnen worden geïdentificeerd door immunohistochemie met cytokeratine 8 en 18 kleuring (figuur 2). Voor longitudinale studies, we…

Discussion

We presenteren een protocol voor een orthotope RCC muismodel. Implantatie van muizen renale adenocarcinoom tumorcellen in de muis nier levert een klinisch relevante model mRCC. Dit model levert een primaire tumor in de nieren en metastasen in de longen, die beide kenmerken van geavanceerde RCC. De beschrijving hierin gepresenteerde specifiek is voor het Renca cellijn immunocompetente Balb / c muizen. Met deze orthotope model hebben we aangetoond dat de Renca tumoren reageren op immunotherapie, aantonen van de bruikbaarh…

Materials

Artificial tears ophthalmic ointment	Akorn	NDC 17478-162-35
Vetbond Tissue Adhesive	3M	CBGBIW011019
Betadine Solution (Povidone-iodine, 5%)	Purdue Products, L.P.	NDC 67618-155-32
0.25% Marcaine (bupivavaine HCL injection)	Hospira	0409-1587-50
Heating pad	Sunbeam
Syringes	BD	309659
Gauze	Venture	908291
Ketamine	Phoenix Pharmaceuticals	NDC 57319-609-02
Xylazine	Akorn	NDC 59399-111
Hank’s Balanced Salts	Sigma-Aldrich	H2387
IVIS	Caliper
D-Luciferin, Potassium Salt	GoldBio	LUCK-1G
India Ink	Chartpak Inc	44201
Scissors
Forceps
Sleeping Beauty (SB) transposon system	Neuromics	SBT0200
Renca	ATCC	CRL-2947