Un modèle de souris syngénique rénal métastatique Carcinome cellulaire pour l'évaluation des thérapies quantitatives et longitudinales précliniques

Summary

Mise en oeuvre d'un modèle orthotopique de carcinome rénal chez les souris immunocompétentes donne le chercheur un système cliniquement pertinente définie par la présence d'une tumeur rénale et des métastases pulmonaires primaires dans le même animal. Ce système peut être utilisé pour tester précliniquement une variété de traitements in vivo.

Abstract

carcinome à cellules rénales (RCC) affecte> 60.000 personnes aux Etats-Unis chaque année, et environ 30% des patients RCC ont de multiples métastases au moment du diagnostic. RCC métastasique (CRm) est incurable, avec un temps de survie médian de 18 mois. Interventions à base immunitaire (par exemple, l' interféron (IFN) et l' interleukine (IL) -2) induire des réponses durables dans une fraction des patients CRCR et les inhibiteurs de kinases multiples (par exemple, sunitinib ou sorafenib) ou anti-récepteur de VEGF anticorps monoclonaux (mAb) sont en grande partie palliatives, comme rémissions complètes sont rares. De telles lacunes dans les thérapies actuelles pour les patients MRCC fournissent la justification de l'élaboration de protocoles de traitement nouveaux. Un élément clé dans le test pré-clinique de nouvelles thérapies de MRCC est un modèle animal approprié. caractéristiques bénéfiques qui récapitulent la condition humaine comprennent une tumeur rénale primaire, métastases tumorales rénales, et un système immunitaire intact d'enquêter sur toute effecto immunitaire axée sur la thérapieRéponses r et la formation de facteurs immunosuppresseurs induite par une tumeur. Ce rapport décrit un modèle de souris orthotopique mRCC qui a toutes ces caractéristiques. Nous décrivons une technique d'implantation intrarénal en utilisant la lignée cellulaire rénale de la souris adénocarcinomes Renca, suivi par l'évaluation de la croissance tumorale dans le rein (site principal) et les poumons (site métastatique).

Introduction

Carcinome à cellules rénales (RCC) représente la majorité des tumeurs malignes du rein et environ 3% de toutes les tumeurs malignes des adultes dans le monde entier ^{1, 2.} En raison de l' absence de symptômes, diagnostics erronés, et des outils de dépistage insuffisantes pour RCC, près de 30% des patients présentent un cancer du rein métastatique (MRCC) au moment du diagnostic, avec un 20-30% supplémentaire des patients évoluant vers un stade métastatique ^2. Ces cas donnent lieu à ~ 13.500 décès par an ^{1, 3.} Bien que la détection précoce et le traitement du RCC primaire a amélioré, le taux de décès liés à la RCC continue d'augmenter, ce qui suggère que la maladie métastatique est en grande partie responsable de la mortalité ^3. le développement de la thérapie pour RCC a progressé au cours de la dernière décennie avec la découverte et la mise en œuvre des thérapies ciblées et immunothérapies. Malheureusement, SURVIV sans progressional et la survie globale des cas avancés sont encore bien moins de 2 ans pour la majorité des patients ^{4, 5, 6.} Ces statistiques justifient la nécessité de poursuivre la recherche sur l'identification et le développement de traitements efficaces pour RCC. Pour faire avancer de manière adéquate les interventions thérapeutiques de MRCC, traductionnelle pertinents modèles pré-cliniques de la maladie sont d'abord nécessaires.

Développement d'un modèle pertinent et cohérent pour récapituler la condition humaine du RCC avancé devrait répondre à plusieurs questions clés: 1) Le modèle est anatomiquement pertinent; 2) Est-ce que les progrès de la tumeur de façon similaire à la pathologie humaine; 3) Est-ce métastases proviennent de la tumeur primitive; et 4) peut progression de la tumeur primaire et métastatique surveiller au fil du temps? Selon le type de traitement à l'étude, les lignées cellulaires de souris de tumeurs RCC, des lignées de cellules tumorales RCC humaines et xenog patient humain dérivé RCCradeaux peuvent être utilisés dans des souris immunocompétentes ou immunodéprimées. Un hôte avec un système immunitaire intact et fonctionnel est requis pour ces études évaluant un aspect de l' immunothérapie, ce qui nécessite l'utilisation de la lignée de cellules Renca bien décrit dérivée d'un adénocarcinome rénal spontanée des souris Balb / c ^7. La plupart des études injectent cellules RENCA sous – cutanée (sc), qui forme une tumeur locale facile à mesurer, ou par voie intraveineuse (iv) à des souris Balb / c pour produire des "métastases" pulmonaires expérimentales ^{8, 9, 10, 11, 12.} Utilisation d'une tumeur Renca implanté sc-RCC au modèle humain a un certain nombre de limitations, y compris innervation inexacte de vascularisation ^13, les différences de microenvironnement ^{14, 15,} et l'absence d'organe / tumeur cellulaire Communication ^{13, 16.} En outre, de nombreuses tumeurs sc ( en particulier Renca) ne métastasent pas aux organes distaux, l' inhibition de l'étude d'un événement qui est une caractéristique clinique commune ^17. Pour étudier CRm, cellules RENCA peuvent être injectées par voie iv à établir la charge tumorale dans les poumons, l'emplacement principal de métastases chez des patients atteints de RCC. La méthode d'injection par voie intraveineuse d'initier des tumeurs métastatiques, cependant, ne permet pas l'étude de la manière dont, quand, ou pourquoi les cellules ont migré de l'organe primaire ( par exemple, le rein) vers le site distant. Un modèle à la fois la maladie primaire et métastatique évidente dans le même animal est cruciale pour étudier la progression et le traitement de la maladie avancée, d'autant plus que les métastases sont généralement la cause de mortalité chez ces patients.

Notre laboratoire a mis au point un modèle murin de mRCC qui intègre toutes les fonctionnalités décrites ci-dessus. Pour établir prtumeurs imary, orthotopique, cellules RENCA sont implantés directement dans le rein de l'animal à travers le péritoine translucide. Une petite incision dans le flanc gauche permet la visualisation de la rate (en tant que point de repère), et le rein gauche. En utilisant une aiguille de petit calibre, les cellules tumorales Renca sont injectés directement dans le rein à travers le péritoine pour une implantation orthotopique. Par rapport à d' autres méthodes d'implantation de cellules Renca sous la capsule du rein ^18, cette méthode d'implantation permet un débit plus élevé, car il est assez non invasive, ne nécessite pas suturer, est d'une classe faible de la douleur, et le temps efficace lorsque exercé.

Ces résultats du modèle bien caractérisé en charge de la tumeur primaire reproductible (~ de taux d'utilisation de 99%) dans le rein injecté ainsi que la charge de la tumeur métastatique dans les poumons. Les avantages significatifs de ce modèle sont sa nature syngéniques, ce qui permet des enquêtes d'immunothérapie; ses métastases spontanées, pour étudier unemaladie VANCÉES; et son implantation orthotopique, pour modéliser l'impact anatomique sur la progression et le traitement des maladies. Les thérapies visant à cibler RCC bénéficieraient grandement de l'utilisation de ce modèle au cours du développement pré-clinique.

Protocol

Le protocole suivant décrit une procédure expérimentale pour induire et surveiller la croissance des tumeurs rénales orthotopique expérimentales et des métastases spontanées potentielles. Toutes les procédures suivantes sont effectuées conformément aux politiques et procédures approuvées institutionnelles concernant l'utilisation humaine des animaux de laboratoire. 1. Entretien de lignées cellulaires Maintenir la lignée cellulaire d'adénocarcinome rénal murin, Renca, dans Roswe…

Representative Results

L'implantation réussie de cellules RENCA se traduira par le développement de la tumeur dans le rein et les métastases aux poumons des souris. Après l'excision du porteur d' une tumeur et les reins controlatéraux, des poids de tissu humide (g) ont été mesurés afin de démontrer la charge tumorale par rapport au poids accru (figure 1). Les tumeurs RENCA peuvent être identifiés par immunohistochimie par cytokératine 8 et 18 coloration (F…

Discussion

Nous présentons un protocole pour un modèle de souris RCC orthotopique. L'implantation de cellules tumorales d'adénocarcinome rénal de souris dans le rein de souris constitue un modèle clinique pertinente de CRm. Ce modèle se traduit par une tumeur primaire dans le rein et métastases distantes dans les poumons, qui sont tous deux caractéristiques de RCC avancé. La description présentée ici est spécifique pour la lignée de cellules immunocompétentes Renca dans des souris Balb / c. En utilisant ce mo…

Materials

Artificial tears ophthalmic ointment	Akorn	NDC 17478-162-35
Vetbond Tissue Adhesive	3M	CBGBIW011019
Betadine Solution (Povidone-iodine, 5%)	Purdue Products, L.P.	NDC 67618-155-32
0.25% Marcaine (bupivavaine HCL injection)	Hospira	0409-1587-50
Heating pad	Sunbeam
Syringes	BD	309659
Gauze	Venture	908291
Ketamine	Phoenix Pharmaceuticals	NDC 57319-609-02
Xylazine	Akorn	NDC 59399-111
Hank’s Balanced Salts	Sigma-Aldrich	H2387
IVIS	Caliper
D-Luciferin, Potassium Salt	GoldBio	LUCK-1G
India Ink	Chartpak Inc	44201
Scissors
Forceps
Sleeping Beauty (SB) transposon system	Neuromics	SBT0200
Renca	ATCC	CRL-2947