المحفزة الخلايا الجذعية المشتقة خلايا القلب لإصلاح عضلة القلب
Summary
نقدم ثلاثة بروتوكولات جديدة وأكثر كفاءة للتمييز الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان إلى العضلية، والخلايا البطانية، وخلايا العضلات الملساء وطريقة التسليم أن يحسن engraftment من الخلايا المزروعة عن طريق الجمع بين حقن الخلايا مع بوساطة التصحيح تسليم خلوى.
Abstract
الناجمة عن النشاط البشري الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSCs) يجب أن تكون متمايزة تماما في أنواع معينة من الخلايا قبل الإدارة، ولكن البروتوكولات التقليدية للتمييز hiPSCs إلى العضلية (hiPSC-CMS)، والخلايا البطانية (hiPSC-ECS)، وخلايا العضلات الملساء (SMCS) غالبا ما تكون محدودة بسبب العائد المنخفض، والنقاء، و / أو ضعف الاستقرار المظهرية. هنا، نقدم بروتوكولات جديدة لتوليد hiPSC-مضادة، -ECs، و-SMCs التي هي إلى حد كبير أكثر كفاءة من الطرق التقليدية، فضلا عن طريقة للجمع بين حقن الخلايا مع التصحيح التي تحتوي على خلوى تم إنشاؤها على موقع الإدارة. التصحيح يحسن كلا من الإبقاء على حقن الخلايا، بإغلاق الطريق إبرة لمنع الخلايا من طرده من عضلة القلب، وبقاء الخلية، عن طريق الإفراج عن عامل النمو الذي يشبه الانسولين (IGF) على مدى فترة ممتدة. في نموذج الخنازير من عضلة القلب إصابة نقص التروية، ضخه، كان معدل engraftment أكثر من شقين أكبر عندماكانت تدار الخلايا مع التصحيح التي تحتوي على خلوى مقارنة مع الخلايا دون التصحيح، والمعاملة مع كل من الخلايا والتصحيح، ولكن ليس مع الخلايا وحدها، كان مرتبطا مع تحسينات كبيرة في وظيفة القلب وحجم احتشاء.
Introduction
الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان (hiPSCs) هي من بين العوامل الواعدة لعلاج الخلايا على التجدد لأنها يمكن أن تكون متباينة في مجموعة ويحتمل أن تكون غير محدودة وكمية من الخلايا التي لا يرفضها الجهاز المناعي للمريض. ومع ذلك، قدرتها على النسخ المتماثل الذات والتمايز يمكن أن يؤدي أيضا إلى تشكيل الورم، وبالتالي تحتاج إلى أن تكون متمايزة تماما في أنواع معينة من الخلايا، مثل العضلية (CMS)، والخلايا البطانية (ECS)، وخلايا العضلات الملساء hiPSCs (SMCS )، قبل الإدارة. واحد من أبسط والأكثر شيوعا أساليب إدارة الخلية هو حقن داخل عضلة القلب مباشرة، ولكن عدد الخلايا المزروعة التي المغروسة من قبل الأنسجة القلبية المحلية منخفضة بشكل استثنائي. الكثير من هذا الاستنزاف يمكن أن يعزى إلى البيئة السامة للخلايا الأنسجة الدماغية. ومع ذلك، عندما كانت الفئران الخلايا الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية) حقنها مباشرة في عضلة القلب من قلوب لم يصب، سنلي ~ 40٪ من 5 ملايين الخلايا تسليمها تم الاحتفاظ لمدة 3-5 ساعة 1، مما يشير إلى أن نسبة كبيرة من الخلايا تدار خرجت موقع الإدارة، ربما لأنهم يحرمونهم من خلال المسار الإبرة من الضغوط العالية التي تنتج أثناء تقلص عضلة القلب.
هنا، فإننا نقدم طرق جديدة وإلى حد كبير أكثر كفاءة لتوليد العضلية المستمدة hiPSC (hiPSC-CMS) 2، والخلايا البطانية (hiPSC-ECS) 3، وخلايا العضلات الملساء (SMCS) 4. والجدير بالذكر أن هذا البروتوكول hiPSC-SMC هو اول محاولة لتقليد مجموعة واسعة من الخصائص المورفولوجية والوظيفية لوحظ في الجسدية SMCS 5 عن طريق توجيه الخلايا نحو SMC النمط الظاهري في الغالب الاصطناعية أو مقلص. ونحن نقدم أيضا وسيلة لتسليم خلية التي تعمل على تحسين معدل engraftment من حقن الخلايا عن طريق إنشاء التي تحتوي على خلوى الفيبرين صatch على موقع الحقن. ويبدو أن التصحيح لتحسين كل من الاحتفاظ خلية عن طريق ختم المسار إبرة لمنع الخلايا من الخروج من عضلة القلب، وبقاء الخلية، عن طريق الإفراج عن عامل النمو الذي يشبه الانسولين (IGF) على مدى ثلاثة أيام على الأقل.
Protocol
Representative Results
Discussion
تحسين الإنتاجية / الطهارة من hiPSC-مضادة
البروتوكولات التقليدية للتمييز الخلايا الجذعية البشرية في مضادة غالبا ما تكون محدودة بانخفاض المحصول والنقاء. على سبيل المثال، فقط 35-66٪ من HESC-مضادة الحصول عليها عن طريق فصل Percoll وتشكيل هيئة ال…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by US Public Health Service grants NIH RO1s HL67828, HL95077, HL114120, and UO1 HL100407-project 4 (to JZ), an American Heart Association Scientist Development Grant (16SDG30410018) and a Research Voucher Award from University of Alabama at Birmingham Center for Clinical and Translational Science (to WZ).
Materials
| Protocol 1 | |||
| mTeSR1 medium | Stem cell technologies | 5850 | |
| Growth-factor-reduced matrigel | Corning lifescience | 356231 | |
| Y-27632 | Stem cell technologies | 72304 | |
| B27 supplement, serum free | Fisher Scientific | 17504044 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875-119 | |
| Activin A | R&D | 338-AC-010 | |
| BMP-4 | R&D | 314-BP-010 | |
| bFGF | R&D | 232-FA-025 | |
| Collagenase IV | Fisher Scientific | NC0217889 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhydrous) | Fisher Scientific | 14175079 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10438018 | |
| 6-well plate | Corning Lifescience | 356721 | |
| 10cm dish | Corning Lifescience | 354732 | |
| Cell incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 2 | |||
| Versene | Fisher Scientific | 15040066 | |
| Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F8630-5g | |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T7009-1KU | |
| EMB2 medium | Lonza | CC-3156 | |
| VEGF | ProSpec-Tany | CYT-241 | |
| EPO | Life Technologies | PHC9431 | |
| TGF-ß | Peprotech | 100-21C | |
| EGM2-MV medium | Lonza | CC-4147 | |
| SB-431542 | Selleckchem | S1067 | |
| CD31 | BD Bioscience | BDB555445 | |
| CD144 | BD Bioscience | 560411 | |
| 15 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 12565269 | |
| Eppendorff Centrifuge | Eppendorf | 5702R | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 3 | |||
| CHIR99021 | Stem cell technologies | 720542 | |
| PDGF-ß | Prospec | CYT-501-10ug | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 4 | |||
| Olive oil | Sigma-Aldrich | O1514 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| IGF | R&D | 291-G1-01M | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | 15561020 | |
| Heating plate | Fisher Scientific | SP88850200 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10Q | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 5 | |||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 223506 | |
 -aminocaproic acid |
Sigma-Aldrich | A0420000 | |
| MEM medium | Fisher Scientific | 12561-056 | |
| Syringe | Fisher Scientific | 1482748 | |
| Anesthesia ventilator | Datex-Ohmeda | 47810 | |
| Anesthesia ventilator | Ohio Medical | V5A | |
| Defibrillator | Physiol Control | LIFEPAK 15 | |
| 1.5T MRI | General Electric | Signa Horizon LX | |
| 7T MRI | Siemens | 10018532 | |
| Gadolinium Contrast Medium (Magnevist) | Berlex | 50419-188-02 | |
| 2-0 silk suture | Ethilon | 685H | |
| 3-0 silk suture | Ethilon | 622H | |
| 3-0 monofilament suture | Ethilon | 627H |
Referenzen
- Qiao, H., et al. Death and proliferation time course of stem cells transplanted in the myocardium. Mol Imaging Biol. 11 (6), 408-414 (2009).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Zhang, S., Dutton, J. R., Su, L., Zhang, J., Ye, L. The influence of a spatiotemporal 3D environment on endothelial cell differentiation of human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (12), 3786-3793 (2014).
- Yang, L., et al. Differentiation of Human Induced-Pluripotent Stem Cells into Smooth-Muscle Cells: Two Novel Protocols. PLoS One. 11 (1), e0147155 (2016).
- Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity. Neth Heart J. 15 (3), 100-108 (2007).
- Xu, C., Police, S., Hassanipour, M., Gold, J. D. Cardiac bodies: a novel culture method for enrichment of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 15 (5), 631-639 (2006).
- Anderson, D., et al. Transgenic enrichment of cardiomyocytes from human embryonic stem cells. Mol Ther. 15 (11), 2027-2036 (2007).
- Huber, I., et al. Identification and selection of cardiomyocytes during human embryonic stem cell differentiation. FASEB J. 21 (10), 2551-2563 (2007).
- Kita-Matsuo, H., et al. Lentiviral vectors and protocols for creation of stable hESC lines for fluorescent tracking and drug resistance selection of cardiomyocytes. PLoS One. 4 (4), e5046 (2009).
- Choi, K. D., et al. Hematopoietic and endothelial differentiation of human induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (3), 559-567 (2009).
- Woll, P. S., et al. Wnt signaling promotes hematoendothelial cell development from human embryonic stem cells. Blood. 111 (1), 122-131 (2008).
- Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1701-1710 (2011).
- Rufaihah, A. J., et al. Endothelial cells derived from human iPSCS increase capillary density and improve perfusion in a mouse model of peripheral arterial disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (11), e72-e79 (2011).
- Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
- Qu, Z., et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy. J Cell Biol. 142 (5), 1257-1267 (1998).
- Tang, X. L., et al. Intracoronary administration of cardiac progenitor cells alleviates left ventricular dysfunction in rats with a 30-day-old infarction. Circulation. 121 (2), 293-305 (2010).
- Zeng, L., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
- Davis, M. E., et al. Local myocardial insulin-like growth factor 1 (IGF-1) delivery with biotinylated peptide nanofibers improves cell therapy for myocardial infarction. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8155-8160 (2006).
- Li, Q., et al. Overexpression of insulin-like growth factor-1 in mice protects from myocyte death after infarction, attenuating ventricular dilation, wall stress, and cardiac hypertrophy. J Clin Invest. 100 (8), 1991-1999 (1997).
- Wang, L., Ma, W., Markovich, R., Chen, J. W., Wang, P. H. Regulation of cardiomyocyte apoptotic signaling by insulin-like growth factor I. Circ Res. 83 (5), 516-522 (1998).
- Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510 (7504), 273-277 (2014).
