Effektive Isolation von funktionellen Inselchen von Neonatal Maus Pancreas

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Protokoll hier für intakte Inseln von neugeborenen Mäusen zu isolieren. Bauchspeicheldrüsen wurden teilweise mit Kollagenase, gefolgt von Waschen und Hand picking verdaut. 20-80 islet Cluster können pro Bauchspeicheldrüse von neugeborenen Mäusen erhalten werden, die für mehrere islet Studien geeignet sind.

Zusammenfassung

Perfusions-basierte Inselisolierung Protokolle von großen Säugetieren Bauchspeicheldrüsen sind gut etabliert. Solche Protokolle sind in vielen Laboratorien aufgrund der großen Größe der Pankreasgang, der ermöglicht bereit Kollagenase Injektion und anschließende Gewebeperfusion leicht durchgeführt. Im Gegensatz dazu Inselisolierung von kleinen Bauchspeicheldrüsen, wie die von neugeborenen Mäusen, ist schwierig, weil die Perfusion nicht leicht erreichbar in dem kleinen pancreata ist. Hier haben wir ein detailliertes einfaches Verfahren beschreiben, die von neu geborenen Mäusen, die mit visuellen Unterstützung einer beträchtlichen Zahl von Inseln erholt. Frisch sezierte ganze Bauchspeicheldrüsen wurden mit 0,5 mg / ml Kollagenase IV in Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS) bei 37 ° C, in Mikrozentrifugenröhrchen gelöst verdaut. Die Röhrchen wurden regelmäßig zu unterstützen Gewebe Zerstreuung angezapft. Wenn der größte Teil des Gewebes zu kleinen Gruppen etwa 1 mm dispergiert, drei- bis viermal mit Nährmedien Lysate wurden mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), gewaschen. Islet Cluster,ohne erkennbare acinar Gewebe kann dann unter Sezieren Stereoskop zurückgewonnen werden. Dieses Verfahren gewinnt 20 - 80 kleine bis große Inseln pro Bauchspeicheldrüse von Neugeborenen Maus. Diese Inseln sind für die meisten denkbaren Downstream-Assays, einschließlich der Insulinsekretion, Genexpression und Kultur. Ein Beispiel für die Insulinsekretion Assay dargestellt, um den Isolationsprozess zu validieren. Der genetische Hintergrund und der Grad der Verdauung sind die größten Faktoren, die Ausbeute zu bestimmen. Frisch mit hoher Aktivität hergestellt Kollagenase-Lösung wird bevorzugt, da es in endokrin exokrinen Isolation hilft. Die Anwesenheit von Kationen [Calcium (Ca ²⁺⁾ und Magnesium (Mg ^2+)] in allen Lösungen und fötales Rinderserum in der Wasch- / Kommissionierung Medien sind notwendig für eine gute Ausbeute an kleinen Inseln mit der richtigen Integrität. Ein Binokular mit gutem Kontrast und Vergrößerung wird auch dazu beitragen.

Einleitung

Die Isolierung reiner Pankreasinseln ist essentiell für die Bestimmung der glukosestimulierten Insulinsekretion (GSIS) von Betazellen und für die Inseltransplantation von Leichenspendern ^1-3. Es ist auch notwendig, die endokrine Genexpression in Inselzellen zu etablieren ^{4, 5}. Zu diesem Zweck wurden detaillierte Protokolle erstellt, die die Isolierung von Pankreasinseln aus großen Pankreasinseln ermöglichen (⁶ und Verweise darin). Diese Methoden basieren auf enzymatischer Perfusion zur Dissoziation von Azinus aus Inselgewebe, gekoppelt mit Gradiententrennung und Handpflückung. Somit kann die Isolierung von Inselzellen aus einer großen Bauchspeicheldrüse in den meisten Laboratorien problemlos durchgeführt werden. Auf der anderen Seite gibt es kein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll, das die Isolierung von Inselzellen aus der Bauchspeicheldrüse ermöglicht, die zu klein sind, um sie zu durchbluten.

Die Untersuchung der Genexpression und Funktion von Neugeboreneninseln ist wichtig. Neugeborene Inselzellen haben andere Eigenschaften als Erwachsene in Bezug auf Insulinsekretion und Proliferationsfähigkeit ^{7, 8}. Die Isolierung von Inselzellen von neugeborenen Tieren, insbesondere Mäusen, ist jedoch aufgrund der geringen Größe der neugeborenen Bauchspeicheldrüse eine Herausforderung. Die Größe verhindert den üblichen Perfusionsprozess, wenn Kollagenase durch den Pankreasgang injiziert wird. In der Tat wurden in mehreren Arbeiten Studien in dieser Richtung vorgestellt, mit enzym- oder nicht-enzymgestützten Isolierungsverfahren ^{7, 9, 10}. Es fehlt jedoch eine detaillierte Beschreibung des Prozesses der Inselisolierung mit visueller Hilfe ^{7, 9}, was es für die meisten Forscher zu einer Herausforderung macht, ähnliche Studien durchzuführen.

Wir haben verschiedene Bedingungen untersucht, die qualitativ hochwertige Inselzellen von neugeborenen Mäusen hervorbringen. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das den Forschern helfen soll, die wichtigsten Details des Inselisolationsprozesses zu erfahren. Dieses Protokoll ist auf die Bauchspeicheldrüse der Maus bis zu einem Alter von zwei Wochen anwendbar, danach kann eine Perfusion für die routinemäßige Isolierung von Inselzellen durchgeführt werden. Islets können direkt für Insulinsekretions- und Genexpressionsassays verwendet werden.

Protokoll

Tiernutzung nach den festgelegten Verfahren in Protokoll M / 11/181 genehmigt von der Vanderbilt Institutional Animal Care und Use Committee für Gu. CD1 oder CBA / Bl6 Mäuse wurden von kommerziellen Anbietern gekauft und in der Vanderbilt Tieranlage gekreuzt neugeborenen Mäusen erhalten.

1. Herstellung von Mäusen, Stock-Lösungen und Geräte

1. Für die Maus Kreuz: eine Maus Kreuz und notieren Sie die Aufstecken Termine einrichten experimentelle Planung zu unterstützen. CD1-Mäuse geben in der Regel Geburt um Tag 19 nach der Paarung. Verwenden Sie CD1 oder CBA / Bl6 kreuzt CD1 oder CBA / Bl6 Neugeborenen bzw. zu erhalten. Kreuzungen zwischen den beiden Linien nutzen CD1 Weibchen und CBA / Bl6 Männer.
2. Für die Kollagenase Lager: 200 mg Kollagenase Typ IV mit einem hohen Präzisionswaage wiegen. Transfer in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen. Man löst in 40 ml HBSS mit Ca ²⁺ / Mg ²⁺ (1,26 und 0,5 mM jeweils) , um eine 5 mg / ml Stammlösung herzustellen.
   1. Lassen Sie Kollagenasefür ~ 30 min unter leichtem Schütteln lösen. Aliquotieren und die Lösung in -20 ° C als Vorrat eingefroren halten, die für mindestens ein Jahr lang aktiv bleibt.
3. Autoklaven auf mehrere Paare von Pinzetten, Scheren und P20-Tipps für die Präparation und Inselchen Picking sterilisieren.
4. Für die 1 M Glucose Lager: wiegen 9 g Glucose in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen, 50 ml RPMI 1640-Medium, das Glukose zu lösen. Halten Sie in 4 ° C bis zur Verwendung, aber nicht mehr als 6 Monate.

2. Arbeitslösungen

HINWEIS: Der Tag der Inselisolierung, bereiten Sie die folgenden Reagenzien.

1. Für die Kollagenase Typ IV Arbeitslösung: Tauwetter und Kollagenase Lager auf Eis verdünnt. Dispense 0,15 ml Brühe in jedem 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen. In 1,35 ml HBSS mit Ca ²⁺ / Mg ^2+. Drehen Sie das Röhrchen 5 mal. Lassen Sie auf Eis für 15 min.
   1. Spin bei hoher Geschwindigkeit für 3 Minuten in einer Mikro. Überstand in ein neues Röhrchen. Lassen Sie auf Eis bis zum Gebrauch. Entsorgen Sie das Rohr mit unlöslichen Ablagerungen.
2. Zur vollständigen RPMI 1640 Medium: 2,5 ml 1 M Glucose, 50 ml hitzeinaktiviertem FBS und 5 ml 100x Pen-Strep Lager in 500 ml RPMI 1640 Medien hinzuzufügen. Lassen Sie auf Eis bis zum Gebrauch.

3. Pancreas Isolierung und Verdauung

1. Euthanize Neugeborenen mit Isofluran, gefolgt von Enthauptung nach anerkannten Protokollen.
2. Legen Sie die Maus mit dem Bauch nach oben zeigt. Spray mit 70% Ethanol für die Sterilisation.
3. Heben Sie die Bauchhaut mit einer Pinzette und schneiden Sie die Haut und Muskelschichten in Längsrichtung entlang der Mittellinie mit einer Schere aus dem Genitalbereich des Brustkorbs. Dies öffnet die Bauchhöhle alle inneren Organe zu belichten.
4. Übertragen Sie alle inneren Organe zu einer 100-cm-Schale mit einer Pinzette. Suchen Sie die Bauchspeicheldrüse, die ein Streu Orgel mit einem Rückenteil ist , das in den Magen und Milz und eine ventrale Teil klammert , die ¹¹ bis Duodenum klammert.
5. In HBSS in die Schüssel, die Organe zu versenken. In Lösung klammern die Pankreasgewebe nicht mehr auf den Zwölffingerdarm, Magen oder Milz. Es ist ohne weiteres erkennbar unter einem Binokular wegen seiner typischen weißen Farbe. Verwenden einer Pinzette die Pankreasgewebe weg vom umgebenden Gewebe und an einem neuen 60-mm-Schale mit HBSS zu schälen.
6. Schneiden Sie jede Bauchspeicheldrüse mit einer Schere in Stücke kleiner als 5 mm über beliebigen Abmessungen. Transfer zu einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Bis zu fünf Bauchspeicheldrüsen (jünger als P7) kann in einem Röhrchen verdaut werden. Für P8-P16 Mäuse, verwenden Sie eine Röhre pro Bauchspeicheldrüse.
7. In 0,5-1 ml Kollagenase Arbeitslösung in jedes Röhrchen (0,2 ml pro P1-P7 Bauchspeicheldrüse Verwenden Sie 0,5 ml für jede P8-P16 Bauchspeicheldrüse.). Lassen Sie das Rohr in einem 37 ° C Inkubator für bis zu 15 min. Drehen Sie das Rohr zwei Mal pro min.
8. Nach ca. 5 min, tippen Sie auf das Rohr die Verdauung Status des Pankreasgewebe zu überwachen. Weiter den Verdauungsprozess, bis die meisten der PankreasGewebe erscheint als fragmentierten Zellcluster, mit einem Durchmesser von <2 mm. Das Lysat wird trüb erscheinen, die den normalen Azinuszelltumoren Autolyse zurückzuführen ist.

4. Lysate Waschen

1. Drehen Sie das Lysat bei 500 × g für 10 s in einer Mikro. Entfernen Sie die überstehende Schicht mit einem P1,000 Pipetman. Der Überstand sollte erscheinen trübe, aber ohne Zellhaufen. verwenden aspiration nicht, die die Gewebefragmente an der Unterseite durch die Anwesenheit von etwas klebrig DNA schnell abzusaugen weg kann.
2. 1 ml RPMI 1640 Komplettmedium. Tippen Sie auf das Rohr sanft die fragmentierte Lysat wieder zu suspendieren. Kehren nach oben und unten 10-mal. Wiederholen Sie Schritt 4.1.
3. Wiederholen Sie Schritt 4.2 zwei weitere Male oder bis der Überstand klar erscheint. Re-suspend gewaschenen Pankreas Fragmente in 1 ml komplettem RPMI 1640-Medium.

5. Islet Isolation

HINWEIS: Bei einer kleinen Anzahl von Bauchspeicheldrüsen, direkte Handlese, wie unten (5.1) kann für die Insel isol verwendet werdenation. Für große Anzahlen von Bauchspeicheldrüsen (> 6), wobei das Verfahren in 5.2 skizziert ist bevorzugt.

1. Direkt Handlese:
   1. Übertragen Sie Lysat aus Schritt 4.3 zu einer 60-mm-Schale. In 5 ml komplettem RPMI 1640-Medium. Bringen Sie unter einem Binokular.
   2. Stellen Sie die Hellfeldbeleuchtung auf dem Mikroskop auf. Stellen Sie die Lichtintensität auf ~ 50% der maximalen Leistung. Unter dieser Bedingung erscheinen Inseln als leicht rosa Cluster, während Acinuszellen als dunkle unregelmäßig geformte Cluster (Abbildung 1A). Eine Vergrößerung von ~ 50X (die Leistung des Objektivs zu kombinieren und das Augenteil) wird empfohlen, die beste Art und Weise zu visualisieren Inseln und die Pipettenspitze Öffnung gleichzeitig für die Kommissionierung zu bieten.
   3. Pick-up-Inseln mit einem P20-Pipettenspitze während acinar Cluster zu vermeiden. Dispense Inselchen angereicherten Fraktionen auf eine neue 60 - mm - Schale mit RPMI Komplettmedium (1B).
   4. Wiederholen Sie die Hand-Picking-Prozess noch zweimal. Lassen Sie rein Inseln in eine neue 60mm - Schale mit 4 ml komplettem RPMI Medium (1C).
2. Gradientenzentrifugation:
   1. Vorbereiten eines 15 ml Zentrifugenröhrchen, die mit 2 ml Polysaccharose und Natriumdiatrizoat in einer Dichte von 1,077 g / ml vorgespannt ist. Lassen Sie das Röhrchen auf Eis bis zum Gebrauch.
   2. Übertragung der Suspension aus Schritt 4.3 auf der Oberseite des Polysaccharose und Natriumdiatrizoat-Lösung mit einer Pasteur-Pipette. Sie nicht die untere Schicht stören. Gewebe von bis zu 10 neu geboren oder 2 P17 Bauchspeicheldrüsen können in jede 15 ml-Röhrchen geladen werden.
   3. Drehe das Röhrchen bei ~ 600 xg in einem Schwenkrotor für 15 min bei 4 ° C. Verwenden Bremse-Aus-Einstellungen.
   4. Nach Zentrifugation übertragen die Medien und Zwischenphasenschichten (man beachte, dass unter idealen Betriebsbedingungen werden die Inseln in der Zwischenphase zwischen Polysaccharose und Kulturmedien nach dem Zentrifugieren befinden) in ein neues 15 ml-Röhrchen. In 10 ml Medien mischen vorsichtig , aber gründlich.
   5. Spin down die Insel angereicherte Fraktionbei 300 xg für 5 min. Entfernen Sie die Waschmedien. Wiederholen Sie die Wäsche noch einmal mit komplettem RPMI-Medien. Resuspendieren Pellets in bis 4 ml Medien, die meist kleinen Inseln und Kanälen (Abbildung 1D) enthält.
   6. Hand holen die kleinen Inseln, wie in Abschnitt 5.1 beschrieben.

6. GSIS Assays in isolierten Inseln

1. Inkubieren der Inseln aus Schritt 5.1.4 in kompletten RPMI-Medium für 2 h in einem 37 ° C Gewebekultur-Inkubator.
2. Verwenden Sie eine Pipette RPMI unter einem Binokular zu entfernen. In 3 ml KRB - Lösung mit 2,8 mM Glucose zu der Platte ^3. Swirl 10-mal die Inseln zu waschen. Entfernen KRB-Lösungen.
   1. Wiederholen Sie einmal, um den Waschvorgang. Inkubieren der Inselchen mit 3 ml KRB-Lösung bei 37 ° C für 1 h in einem Inkubator.
3. Aliquot 1 ml KRB in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte. Pre-warm die KRB Lager und Platte auf 37 ° C in einem Inkubator.
4. Waschen Sie die kleinen Inseln zweimal mit vorgewärmten KRB wie in 6.2. Transfer 10 Inselchen in jede Vertiefung der vorgewärmten Platten. Inkubieren in einem 37 ° C Inkubator.
5. Nach 45 Minuten wurden 50 ul Überstand zurücktreten. Diese enthält die Insulinlösung unter basalen Glukose ausgeschieden.
6. In 32 & mgr; l 500 mM Glucose. Schwenken Sie die Platte 20-mal die Lösung zu mischen. Inkubieren in einem 37 ° C Inkubator. Schwenken Sie die Platte 5 mal einmal alle 5 min.
7. Nach 45 min zurückziehen 50 & mgr; l Überstand. Dies ist das Insulin unter hohem Glucose sekretiert.
8. Übertragen Sie alle Inseln in ein 1,5 ml-Röhrchen. Einfrieren in -20 ° C für 30 min. Tauen Sie für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie das Einfrieren und Auftauen Prozess.
9. In 0,5 ml 70% Ethanol mit 20 mM HCl. Lassen Sie über Nacht. Dies ist das Insulin links in Inselchen.
10. Verwenden herkömmlicher ELISA auf den Insulinspiegel Assay, zuvor beschriebenen ^3.

Ergebnisse

Unter optimalen Bedingungen kann das vorgestellte Verfahren ergeben 20 - 80 Inseln aus jeder kleinen Maus Bauchspeicheldrüse. Diese Zahl hängt von dem genetischen Hintergrund, dem Alter der Mäuse, und die Größe der Inseln zurückgewonnen werden. Unter den üblicherweise verwendeten, CD1 aus gezüchtet und C57BL / 6J reinrassige Mäuse produzieren weniger Inselchen mit geringerer Größe als Hybrid zwischen CD1 und C57BL / 6 oder kommerziellen B6CBAF1 / J-Mäuse tun. Direkt Hand Kommissionierung...

Diskussion

Hier bieten wir eine Schritt-für-Schritt-Protokoll auf Inselisolierung von Bauchspeicheldrüsen, die für konventionelle Perfusion zu klein sind. Es wird erwartet , Inselchen bereit für alle islet-basierten Untersuchungen wie beta-Zellreinigung, Genexpressionsanalyse, islet beta-Zell - Reifung, Proliferation, Zellstressreaktionen, Zellüberleben, Metabolismus und funktionelle GSIS Wartung, usw. zu ergeben. Dies wird nach bestem Wissen unseren Erkenntnissen die erste detaillierte visuelle Protokoll, das neue Forsch...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Kollagenase Typ IV	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	C5138
1x HBSS mit Ca2+/Mg2+	Mediatech/Cellgro, Manassas, VA	MT21020CV	Wenn HBSS ohne Ca2+/Mg2+ erhalten wird, können CaCl2 und MgSO4 zu 1,26 bzw. 0,5 mM.
RPMI 1640 ohne Glukose	Thermo Fisher Scientific/Life Technologies, Waltham, MA	11879-020	Glukose muss in bestimmten Mengen zugesetzt werden, um die spätere Nutzung der Inselzellen nicht zu beeinträchtigen.
Glukose	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	G-7021
Polysaccharose- und Natriumdiatrizoatlösung	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	Histopaque-10771
Stereoskop	Carl-Zeiss, Oberkochen, Deutschland	Stemi2000
Stereoskop	Leica, Wetzlar, Deutschland	Leica M165
Mikrozentrifuge	Eppendorf, Hauppauge, NY	Zentrifuge 5417C
Zentrifuge	Eppendorf, Hauppauge, NY	Zentrifuge 5810R
15-mL Zentrifugenröhrchen	VWR, Radnor, PA	89039-666
50-mL Zentrifugenröhrchen	VWR, Radnor, PA	89039-658
Präzisionswaage	VWR, Radnor, PA	VWR-225AC
Mikrofugeröhrchen	VWR, Radnor, PA	87003-294
Pipetman P1000	Fisher Scientific,  Waltham, MA	F123602
Pipetman P20	Fisher Wissenschaftlich,  Waltham, MA	F123600
100 x 15 mm Schale	VWR, Radnor, PA	25384-088
60 x 15 mm Schale	VWR, Radnor, PA	25384-168
12-Well-Platten	VWR, Radnor, PA	665-180
Schere	Fine Scientific Tools, Foster City, CA	14080-11
Pinzette	Fine Scientific Tools, Foster City, CA	5708-5
CD1-Mäuse	Charles River Laboratories, Wilminton, MA	CD-1
C57BL/6J	Das Jackson-Laboratorium, Farmington, Connecticut;	C57BL/6J
B6CBAF1/J	Das Jackson-Laboratorium, Farmington, Connecticut;	B6CBAF1/J