Протокол Microplastics Отбор проб на поверхности моря и анализа проб

Summary

Протокол ниже описывает методику: microplastics отбор проб на поверхности моря, разделение микропластической и химической идентификации частиц. Этот протокол в соответствии с рекомендациями по мониторингу microplastics, опубликованных MSFD Технической подгруппы по морскому мусору.

Abstract

Microplastic pollution in the marine environment is a scientific topic that has received increasing attention over the last decade. The majority of scientific publications address microplastic pollution of the sea surface. The protocol below describes the methodology for sampling, sample preparation, separation and chemical identification of microplastic particles. A manta net fixed on an »A frame« attached to the side of the vessel was used for sampling. Microplastic particles caught in the cod end of the net were separated from samples by visual identification and use of stereomicroscopes. Particles were analyzed for their size using an image analysis program and for their chemical structure using ATR-FTIR and micro FTIR spectroscopy. The described protocol is in line with recommendations for microplastics monitoring published by the Marine Strategy Framework Directive (MSFD) Technical Subgroup on Marine Litter. This written protocol with video guide will support the work of researchers that deal with microplastics monitoring all over the world.

Introduction

Microplastic pollution in the sea represents a growing concern to contemporary society, due to the constant increase in plastic production and its subsequent disposal and accumulation in the marine environment¹. Even if plastic macro litter would no longer enter the seas, microplastic pollution would continue to grow due to fragmentation of already existing plastic litter in the sea². The majority of microplastic pollution studies were carried out in marine and fresh water ecosystems and mainly addressed sea surface pollution³.

The term microplastic refers to plastic particles smaller than 5 mm in size⁴. This term describes a heterogeneous mixture of particles, which can differ in size (from a few microns to several millimeters), color and shape (from very different shapes of fragments to long fibers). Microplastic particles can be of a primary or secondary origin⁵. Microplastic of primary origin is manufactured as small particles used in the cosmetics industry (pilling crème etc.) or chemical industry as precursor for other plastic products (e.g. plastic pellets used in plastic industry). Microplastic of secondary origin arise via the degradation of larger plastic pieces in the environment due to physical and chemical processes, induced by light, heat, oxygen, water and organisms⁶. In 2015, four types of microplastic sources were defined: larger plastic litter, cleaning products, medicines and textiles⁶. The main source (80 %) of larger plastic litter is assumed to be land based⁷. Microplastic from cosmetic products, medicines and textile enters water ecosystems through sewage and storm waters⁶. Microplastic particles most frequently found in water ecosystems are fragments from larger plastic litter and textile fibers⁸.

Microplastics have several negative effects on the environment. Their small size allows them to enter the food web through ingestion by marine organisms^{9, 10}. Ingested particles can cause physical damage or block the digestive system of animals¹¹. Particles can also be carriers of persistent organic pollutants (POPs). Their hydrophobic surface and favorable ratio of large surface area to small volume, enables POPs to adsorb onto the microplastics¹². In the environment or digestive systems of animals who ingest them, POPs and other plastic additives can be leached from microplastic particles¹³.

Previous studies reported the ubiquitous presence of microplastics in the marine environment³, from the water column to the bottom sediments. The threat of microplastic pollution was already identified by the Marine Strategy Framework Directive in the EU and, consequently, mandatory monitoring of microplastics was advised¹⁴. Accordingly, the EU Technical Subgroup on Marine Litter (TSG-ML) prepared recommendations for monitoring of microplastics in the European seas¹⁵. Thus, the video guidelines for microplastics sampling are of high importance, as they support comparative monitoring and a coherent management process all over the world.

This protocol was developed within the DeFishGear project for the first monitoring of microplastic pollution in the Adriatic Sea. Recommendations from the document “Guidance on Monitoring of Marine Litter in European Seas” by TSG-ML¹⁵ were taken into account. This protocol describes the methodology for microplastics sampling on the sea surface, separation of microplastics from the samples, and chemical analysis of microplastic particles to confirm that particles are from plastic material and to identify the type of plastic. Sampling was done by the use of a manta net, which is the most suitable equipment for sampling in calm waters¹⁶. Separation of microplastics from the samples was carried out by visual identification using a stereomicroscope. Isolated particles were later chemically identified using Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy and micro FTIR spectroscopy.

Protocol

1. Отбор проб microplastics на поверхности моря Развертывание Манта сетку с борта судна с помощью стрелы спинакер или »A-кадр« с помощью линий и карабины. Развертывание Манта сеть из кильватерной зоны (примерно 3 – 4 м. Расстояние от лодки) с целью предотвращения сбора воды, пострадавших от турбулентности внутри зоны следа. Запишите начальные координаты GPS и начальное время в техпаспорте. Начните двигаться в одном прямом направлении со скоростью ок. 2 – 3 узла в течение 30 мин и начать измерение времени. Через 30 минут остановить лодку и записать окончательные координаты GPS, длина маршрута (самый правильный путь, чтобы вычислить длину от Координирует GPS) и среднюю скорость лодки в техпаспорте при условии и поднимите Manta сеть из вода. Ополосните Manta сеть тщательно от внешней сети с морской водой с помощью погружного насоса или воду из лодки ватер резервуар. Полоскание в направлении от Manta рта до конца трески, чтобы сконцентрировать все частицы, прилипшие к сети в конце трески. Примечание: Никогда не сполоснуть образец через отверстие сетки для предотвращения загрязнения. Безопасное извлечение конца трески и просеять образец в трески конец через 300 мкм размером меш сито или менее. Полоскание кутце тщательно снаружи, так и влить остальную часть образца через сито. Повторите этот шаг, пока не останется больше никаких частиц внутри конца трески. Концентрат весь материал на сите в одной части сита. При использовании воронки, промыть сито в стеклянную банку или пластиковую бутылку с использованием 70% этанола. Закройте бутылку, протрите его бумажным полотенцем и маркировать крышку и снаружи банку с именем образца и датой с водонепроницаемым маркером (вы должны поставить вторую метку написанную карандашом на Velum бумаге в банке, чтобы избежать возможной потери изназвание образца из-за стертой этикетки на банку). Перенести меченого пластиковую бутылку в прохладную коробку. Обратите внимание на общие условия отбора проб: Скорость ветра не должна быть больше, чем 2 Бофорта, так как волны слишком высоки, а сеть не стабильна на поверхности моря. Важно, чтобы поддерживать устойчивый линейный ход с постоянной скоростью в течение тралов. Половина Манта чистого открытия должна быть погруженными во время отбора проб. Продолжительность отбора проб должна составлять 30 мин (в тех случаях, когда имеется большое количество натурального материала, например, планктон цветения, продолжительность отбора проб может быть короче). Избегайте использования пластиковых инструментов и контейнеров. Избегайте синтетической одежды (например, флис), канаты и контакт Manta сети с судна, чтобы предотвратить загрязнение образца. Будьте очень осторожны, чтобы не повредить Манта сеть или корпус лодки при развертывании и захватив сеть. 2. Разделение microplastics из образцов морской поверхности Если образец не содержитлюбые элементы размером более 25 мм и, как представляется, чистый, по-прежнему непосредственно с шага 3. Налейте образец через (размер сетки мкм ≤300) сито и удалить все природные или искусственные объекты помет размером> 5 мм (макро и меццо помета) из образца, используя визуальную идентификацию и пинцет. Соблюдайте осторожность, чтобы тщательно споласкивать каждый удаленный объект с дистиллированной водой, чтобы удалить любой мусор микропластической пристали к нему. Храните все природные и искусственные объекты для мусора в отдельных контейнерах. Сушат все природные и искусственные объекты для мусора в эксикаторе (или на открытом воздухе, но в закрытой посуде) и взвесить их. Определить все объекты для мусора> 25 мм (макро мусор) в соответствии с Master Список категорий Урны Пункты 16. После удаления всех крупных объектов, сконцентрировать все оставшиеся части в одной части сита с использованием Брызги бутылок или водопроводной воды. Налейте образец в стеклянном контейнере с использованием минимального количества 70% этанола с помощью Funnэль. Примечание: На этом этапе использование 70% этанола имеет решающее значение для сохранения образца. Также на этапе визуального осмотра образца, этанол способствует обесцвечиванию организмы и красочные пластмассы, поэтому становится легче найти. Возьмите небольшое количество образца (подвыборки) и вылить ее в стеклянную чашку Петри. Анализ образца с использованием стереомикроскопа (20 – 80-кратный зум) и поиск микропластических частиц. Каждая микропластической частица должна быть классифицированы в одну из категорий, перечисленных в таблице 1 и помещают в чашку Петри или других стеклянных флаконах, помеченный название категории. Чашку Петри должен быть закрыт в любое время. Примечание: При разделении microplastics из вашего образца консервативны и выбрать больше, а не меньше частиц для анализа. Реальная химическая структура частиц по-прежнему будет определяться позже. Обязательно анализировать большие объекты со всех сторон, как microplastics может застрять и, следовательно, скрыты под более крупных предметов.Она также может быть полезным, чтобы переместить уже анализируемые объекты на одной стороне чашки Петри. Поместите чашку Петри под микроскопом с измерительного оборудования (окуляр линейки калиброванный по микрометра слайд или программного обеспечения для анализа изображений) и измерить размер каждой частицы (измерения самой длинной диагонали), за исключением нитей, и обратите внимание на его цвет. Каждый подвыборка должен быть рассмотрен другим лицом. Будьте осторожны, чтобы промыть стеклянный контейнер, содержащий образец таким образом, чтобы все частицы, прилипшие к стеклянным стенкам промывают в чашку Петри. Взвесить микропластической частицы каждой категории по отдельности с использованием аналитической шкалы. Микропластической частицы должны быть высушены перед взвешиванием. Замкнутый Петри можно поместить в эксикатор или образцы могут быть оставлены, чтобы высохнуть в закрытой посуде до частиц стала сухой (вес закрытой чашке Петри с частицами постоянна). Определение микро мусор. При анализе образца в поисках microplastics, пожалуйста, считают, чтонекоторые частицы будут легко видны (цвет, форма, размер) в то время как другие могут быть сложнее найти. Ниже приведены несколько особенностей, которые идентифицируют микропластической частиц в образце: Например, отсутствие клеточной структуры, неровные, острые, изогнутые края, равномерной толщины, отличительные цвета (синий, зеленый, желтый и т.д.). 3. Химическая идентификация microplastics ATR-ИК – Фурье – спектроскопии Перед анализом очистить систему обнаружения с алкоголем и безворсовой тканью. Запись фоновый спектр. Поместите образец на держатель образца и собирать спектры. Определение полученных спектров Atr- FTIR с использованием автоматизированного сравнения полученного спектра со спектрами в базе данных. Micro ATR-ИК – Фурье – спектроскопии Перед анализом очистить систему обнаружения с алкоголем и безворсовой тканью. Поместите образец на стеклянном фильтре. Примечание: Другие фильтры могут быть намие изд, но их природа полимера может помешать характеристике. Поместите фильтр с образцом на автоматическом столе сканирования и с помощью джойстика, чтобы найти образец. Запись оптического изображения и отметьте область (например, 20 на 20 мкм), где будет характеризоваться образец. Запись фоновый спектр. Поместите образец на держатель образца и собирать спектры в заранее определенном месте. Определение полученной микро спектров ATR-FTIR с использованием автоматического сравнения полученного спектра со спектрами в базе данных.

Representative Results

Первым результатом описанного протокола являются микропластических частицы классифицируются на шесть категорий в соответствии с их визуальным признакам (таблица 1). Первая категория, и, как правило, наиболее распространенным один, являются фрагментами (рисунок 1). Они являются жесткими, толстые, с острыми изогнутыми краями и неправильной формы. Они могут быть в различных цветовых решениях. Ко второй категории относятся пленки (рисунок 2). Они также появляются в неправильной формы, но по сравнению с фрагментами, они тонкие и гибкие, и, как правило, прозрачные. Третья категория являются гранулы (Рисунок 3), как правило, происходящих из индустрии пластмасс. Они неправильной формы, круглые формы, и как правило, больше по размеру, около 5 мм в диаметре. Они, как правило, плоские, с одной стороны, и может быть различных цветов. Четвертая категория представляют собой гранулы (рисунок 4). По сравнению с гранулами, они имеют правильную круглую форму и, как правило, меньший размер около 1 мм в диаметре. Они появляются в естественных цветах(Белый, бежевый, коричневый). Пятая категория являются нити (рисунок 5). Они, рядом с фрагментами, самый распространенный тип микропластических частиц. Они могут быть короткими или длинными, с различной толщины и цвета. К последней категории являются пенопласты (рисунок 6). Чаще всего они происходят из крупных частиц пенопласт. Они являются мягкими, неправильной формы и от белого до желтого цвета. Основным результатом microplastics отбора проб и анализа выборки является количество микропластических частиц в образце. Эти данные могут быть дополнительно нормированы на км 2. Формула, используемая для нормализации: микропластических частиц в области выборки / отбора проб, где площадь выборки вычисляется путем умножения расстояния выборки на ширину открытия МАНТА сетки (таблицы 2, 3, рисунок 7). Кроме того, частицы могут быть проанализированы с имвозраст программного обеспечения для анализа. Результаты включают в себя максимальную длину и площадь каждой частицы (таблица 4). На рисунке 8а показаны частицы до анализа изображений и рисунке 8б после анализа изображений, где измеряется и пронумерованных каждая частица. Наконец, химический анализ общего или максимально возможное число частиц в образце рекомендуется. С помощью преобразования Фурье ИК-спектроскопии спектр выбранной частицы приобретается, как показано на рисунке 9. Этот спектр сравнивается со спектрами из библиотеки программного обеспечения (рисунок 10). Окончательный результат покажет, будет ли данная частица пластика или нет, и указать тип пластика от химической структуры. 1 Фрагменты 2 Фильмы 3 Пеллеты 4 Пеллеты 5 Filaments 6 пена s Таблица 1: Категории микропластических частиц. Рисунок 1: Пример частиц из категории: Фрагменты. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 2: Пример частиц из категории: Films. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. /55161fig3.jpg "/> Рисунок 3: Пример частиц из категории: Пеллеты. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 4: Пример частиц из категории: Пеллеты. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 5: Пример частиц из категории: филаментов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. <p cдеваха = "jove_content" ВОК: keep-together.within-странице = "1"> Рисунок 6: Пример частиц из категории: Пены. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Отбор проб Расстояние [км] 2 Манта ширина [км] 0,0006 Область выборки [2 км] 0.0012 Таблица 2: Пример данных из обследования, используемых для расчета микропластических частиц на км 2. Нет Нет / км 2 фрагменты 301 250833 фильмы 45 37500 гранулы 15 12500 гранулы 8 6667 пены 33 27500 нити 223 185833 Таблица 3: Пример результатов обследования, где данные классифицируются на 6 групп , не подсчитываются и нормированной на км 2 (No – число частиц). Рисунок 7: Пример типичных результатов после визуальной категоризации рстатьи (No – число частиц). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Индекс Регион Площадь [mm²] Максимальная длина [мм] 1 8,010 5,506 2 10,517 5,628 3 12,185 5,429 4 3,367 3,367 5 2,475 2.155 6 1,809 2,943 7 6,604 5,238 8 5,779 4,037 9 4,472 3,791 10 16,907 5,355 11 7,246 3,733 12 7,867 4,622 13 6,411 5,056 14 3,281 3,070 15 12,937 5,554 16 6,709 3,716 Таблица 4: Пример результатов анализа изображения , где площадь [мм 2] и максимальная длина [мм] каждой частицы измеряются. Рисунок 8: Пример изображения , полученного а) до и б) после того, как анализ изображений частиц с программного обеспечения для анализа изображений.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55161/55161fig8large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 9: Пример спектров , измеренных на выбранной частицы с выраженными пиками и их длин волн [см -1]. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 10: Пример сравнения спектров приобретаемой от выбранной частицы до наилучшего совпадения из спектров библиотеки ATR-FTIR. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этого Figure.

Discussion

Microplastics отбор проб на поверхности моря с помощью Manta сети является широко используемый метод для отбора проб microplastics на поверхности моря, но на сегодняшний день не было ни единой методологии. Большой объем воды может быть отфильтрована через МАНТА сеть, таким образом, возможность захвата соответствующего количества microplastics высока, и результаты воспринимаются как надежные. Сопоставимость результатов среди различных образцов обеспечивается за счет нормализации. В нашем случае, концентрации были связаны с оцифрованного области путем умножения траловый расстояние по горизонтали ширине чистого отверстия. Другой вариант заключается в использовании расходомера, фиксированный в сетку отверстие. Использование расходомера возможно, так как манта сеть с ее боковых крыльев очень устойчива на поверхности моря и, следовательно, прыгая на волнах минимальна. Расходомер регистрирует объем отфильтрованной воды и , таким образом , позволяет нормализацию результатов на объем отобранного воды ^16.

<p class="jove_content"> Наиболее часто используемые манта сети имеют около 300 мкм размер ячейки и 3 – длиной 4,5 м. Эти размеры были оптимизированы, чтобы избежать засорения сети и позволить отбор проб объем воды, как можно больше. Скорость траления рекомендуется находиться в пределах от 2 – 3 узла, но это зависит от высоты волны, скорости ветра и морских течений. Очень важно, что манта сетка находится под наблюдением все время, во время отбора проб, и если он начинает скачкообразной перестройки, скорость траление должна быть уменьшена. Время траления рекомендуется быть около 30 мин, но зависит от концентрации сестоне. Может случиться, что сестон иногда закупоривает Манта сеть. В этом случае траление должен быть немедленно прекращена, иначе микропластической частицы могут быть потеряны, и сеть может быть поврежден. Манта сеть является наиболее часто фиксируется с борта судна. Это также самый подходящий вариант, в то время как манта чистая, безусловно, из зоны следа. В некоторых обследований манта сетка была зафиксирована с кормы судна^{17, 18,} но в этом случае вы должны быть уверены , что сеть находится вне зоны следа. Расстояние, на котором траловый устанавливается для отбора проб, должна быть определена индивидуально, так как зона завихрений , вызванное судна варьируется от размера сосуда и от скорости судна ^{19, 20.}

Разделение микропластических частиц из образцов морской поверхности чаще всего делается только путем визуальной идентификации ^21. Частицы больше чем 1 мм могут быть легко идентифицированы невооруженным глазом, а частицы размером менее 1 мм требуют использования стереомикроскопа. Для того, чтобы уменьшить возможность смущать непластиковых частицы с пластиковые, с помощью поляризации света на стереомикроскопов рекомендуется. Возможность неправильной идентификации пластиковых частиц становится выше с более мелких частиц. Таким образом , частицы> 0,5 мм могут быть идентифицированы только визуально ^21, с использованием стереомикроскопа. Для частиц размером менее 0,5 ммдополнительный, более точный метод необходим , например , микро – ATR-FTIR спектроскопии ^21.

Во время процесса отделения microplastics из образца возможность загрязнения образца с бортовыми филаментов очень высока. По этой причине, контролировать чашки Петри оставлены открытыми на рабочем столе настоятельно рекомендуется для выявления потенциальных загрязняющих частиц в воздухе. А именно, качество данных сильно зависит от: 1) точность человека , работающего с образцом, 2) качества и увеличении стереомикроскопа, и 3) количество органического вещества в образце ^16. После визуальной идентификации настоятельно рекомендуется анализировать отсортированные частицы с одним из имеющихся методов для химической идентификации материала ^8.

Существует несколько способов идентификации полимеров, среди которых спектроскопии ИК-Фурье и спектроскопии комбинационного рассеяния света являются наиболее frequenTLY используется ^22. ИК-Фурье спектроскопии комбинационного рассеяния света и являются взаимодополняющими методы и их точность аналогична. В нашем протоколе, ИК-Фурье и микро ИК-Фурье-спектроскопии с "нарушенного полного внутреннего отражения» (ATR) представлены. Они просты в использовании и позволяют быстро и точные результаты. Пластиковые полимеры обладают высокой специфической инфракрасной (ИК) спектры с различными узорами полосы, что делает ИК – спектроскопии оптимальную методику для идентификации microplastics ^21. Энергия ИК – излучения возбуждает специфическую молекулярную вибрацию при взаимодействии с образцом, который позволяет измерять характеристика ИК – спектров ^22. ИК – Фурье – спектроскопии можно также представить дополнительную информацию о частицах, таких как интенсивность окисления ²³ и уровень деградации ^24. В то время как ATR-FTIR подходит для химической идентификации частиц большего размера (> 0,5 мм), микро-ATR-FTIR-спектроскопия может дать информацию о химическом составе частиц & #60; 0,5 мм, так как она сочетает в себе функцию с помощью микроскопа и инфракрасного спектрометра.

Перед использованием FTIR и микро FTIR спектроскопии, микропластических частицы должны быть предварительно обезвожена, так как вода сильно поглощает инфракрасное излучение ^22, и очищенный, в случае , если они покрыты биопленок и / или других органических и неорганических приверженцев, которые могут влиять на ИК – спектры. Наиболее неинвазивный способ очистки образцов путем перемешивания и промывки пресной водой ^25. Если этого недостаточно, то использование 30% пероксида водорода рекомендуется. Все другие методы могут иметь негативные последствия для микропластических частиц (например, ультразвуковой очистки может дополнительно разбить частицы, сильные кислотные или щелочные растворы могут повредить несколько пластиковых полимеров и т.д.) и, следовательно, их использование не рекомендуется. Более перспективным является использование последовательного ферментативного расщепления как пластический дружественной стадии очистки. После очистки с использованием различных технических ферментов (например, липаза, Amylase, протеиназы, хитиназы, целлюлазы, протеиназы-К) успешно применяется для снижения биологической матрицы планктона и , таким образом , оказался ценный метод для минимизации матричных артефактов при измерениях спектроскопии ИК – Фурье ^22.

Разделение microplastics по визуальной идентификации и химической идентификации отдельных частиц являются чрезвычайно трудоемкие процессы. Эта работа должна быть сделана путем точного и пациента человеком, который имеет опыт работы с стереомикроскопов, а не только в признании пластиковых частиц, но и в признании биологического материала. Даже опытный человек не может различить все возможные частицы микропластической однозначно из хитина или диатомовых фрагментов ^22. Таким образом, частота появления ошибок визуальной сортировки находится в диапазоне от 20% от ²⁶ до 70% , ²¹ и возрастает с уменьшением размера частиц.

Materials

In this protocol no specific equipment or reagents were used.