בידוד של ובתאים אנדותל מן הבריאה מתנדבת ופוטנציאל הנדידה שלהם בהשפעת דגימות סרום לאחר ניתוח הלב
Summary
ובתאי אנדותל (EPCs) מעורבים באופן מכריע על נאווסקולריזציה של רקמות איסכמי. שיטה זו מתארת את הבידוד של EPCs אדם מדם היקפי, כמו גם זיהוי של פוטנציאל הנדידה שלהם נגד דגימות סרום חולי הכירורגיים לב.
Abstract
ובתאי אנדותל (EPCs) מגויס ממח העצם בתנאים פתולוגיים כמו היפוקסיה ומעורב באופן מכריע על נאווסקולריזציה של רקמות איסכמי. מקורו, סיווג ואפיון של EPCs הם מורכבים; יחד עם זאת, שני סוגי המשנה הבולטים של EPCs הוקמו: מה שנקרא "מוקדם" EPCs (המכונה לאחר מכן כבר-EPCs) ומאוחר-תולדה EPCs (מאוחרת EPCs). הם יכולים להיות מסווגים לפי מאפיינים ביולוגיים כמו גם לפי המראה שלהם במהלך בתרבות חוץ גופית. בעוד "מוקדם" EPCs מופיעים פחות משבוע אחרי התרבות של תאים mononuclear היקפי הנגזרות דם במדיה EC-ספציפי, בסוף-תוצאה ניתן למצוא EPCs לאחר 2-3 שבועות. EPCs מאוחרת-תולדה הוכרו להיות מעורבים ישירות נאווסקולריזציה, בעיקר באמצעות יכולתם להתמיין לתאי אנדותל בוגרים, ואילו "מוקדם" EPCs להביע גורמים angiogenic שונים כמו endogenמטען מפוקפק לקדם אנגיוגנזה באופן paracrine. במהלך איסכמיה לבבית / reperfusion (I / R), גורמים שונים לשלוט ביות של EPCs לאזורים של היווצרות כלי דם.
מקרופאג גורם הגירה מעכבת (MIF) הוא ציטוקין פרו-דלקתי דמוי chemokine ו ubiquitously הביע תואר לאחרונה לתפקד רגולטור מפתח כמו הגירת EPCs בריכוזים פיסיולוגיים 1. מעניין, MIF מאוחסן ברכות תאיות ניתן לשחרר במהירות לתוך זרם הדם לאחר כמה גירויים (למשל אוטם שריר לב).
פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד האמין והתרבות של מוקדם EPCs מדם היקפי אדם בוגר המבוסס על מבחר CD34 חיובי עם תרבות עוקבת במדיום המכיל גורמי גדילה האנדותל על צלחות מצופות פיברונקטין לשימוש מבחני הגירה במבחנה נגד דגימות סרום חולי הכירורגיים לב. יתר על כן,שפעת נדידה של MIF על chemotaxis של EPCs לעומת ציטוקינים ממגר אנגיוגנזה ידועה אחרים באה לידי ביטוי.
Introduction
ובתאי אנדותל (EPCs) הם במחזור הדם האנושי ויש להם את היכולת להתמיין לתאי אנדותל 2. הם משתתפים vasculogenesis ומסוגלים מזעור הנזק נגרם על ידי דלקת איסכמיה / reperfusion (I / R) פציעות בדרכים שונות 3, 4. לדוגמה, EPCs מראים רמות גבוהות של אנזימים נוגדי חמצון תוך תאיים כמו catalase, peroxidase גלוטתיון או סופראוקסיד דיסמוטאז מנגן (MnSOD) 5. ההתנגדות המוגבהת מפני סטרס חמצונים מאפשרת EPCs לתפקד microenvironments עם מיני חמצן תגובתי גבוהים (ROS) לאחר פגיעה איסכמית 6. גם מחקרים קודמים הצביעו על כך שמספר EPCs עלול להיות מתואמים תיקון כלי הדם וכי מספר מופחת של מחזורי EPCs מנבא את התרחשותם של אירועים קרדיווסקולריים 7,class = "Xref"> 8. עם זאת, הגדרה ברורה של EPC לא נמצאה עדיין. עד עכשיו, אין סמן משטח תאים ספציפי או פנוטיפ עקבית EPCs ותאים אלה הם נדירים מאוד בדם ההיקפי 9. EPC אדם צריך להיחשב כתא במחזור עם יכולת שיקומה של האנדותל נפצע ומבנים וסקולרית חדשים.
אחת הדרכים לבודד ולאפיין EPCs היא באמצעות הדבקה על פיברונקטין. ובכך, את היכולת של תאים אלה משמשת להראות הידבקות מעולה כדי פיברונקטין מנות צופה לעומת להקליד 1 קולגן, למשל 3, 10, 11. עם זאת, אחרים מצאו כי תאי ציפוי mononuclear על מנות מצופות פיברונקטין וללא שום צעד טיהור קודם או יותר מובילים מושבות כוללות ובתאים מיאלואידית, מונוציטים, ו- T לימפוציטים 12, 13, 14. יתר על כן, במקרה זה, טסיות עלול לזהם את תא mononuclear (MNC) החלק ובכך להעביר חלבונים בממברנה פלזמה לכל תאים חסידים 15.
מלבד אפיון באמצעות מבחני הידבקות במבחנה, שילוב של סמנים פני תא שונים משמש לתיאור סוג תא נחשב כסוג של EPC. במקרה זה, לאחר הידבקות בתיווך פיברונקטין, התאים מנותחים בדבר תכונות אנדותל דמוי שלהם. בתהליך זה, סמנים האנדותל שני הקשורים התא, ליפופרוטאין בצפיפות acetylated-נמוך (acLDL) ו הקולטן לגורם הצמיחה של אנדותל כלי הדם 2 (VEGFR-2, KDR), לשחק תפקיד. תאי מקרופאגים האנדותל הוכחו תופסי acLDL במיוחד בתהליך הנקרא "מסלול תא נבלות" 16. חלבון סמן נוסף הוא KDR בשם רצפטור VEGF העיקרי על האנדותלתאים 17. עם זאת, כפי EPCs בכלל בתרבית התקשורת השלימה עם גורמי גדילת האנדותל נסיוב עגל עוברי, יתכן כי מקרופאגים, אשר ייתכן גם שהוא מבודד בטעות, תערוכת פרופיל סמן אנדותל הדמוי. כפי שהוצג קודם, אם תורבתו בינוני אנדותל ממוזג, מקרופאגים להביע חלבונים "ספציפי האנדותל" 18.
באופן כללי, ישנן שתי קטגוריות של EPCs בתוך תת יותר, אשר ניתן למצוא בדם או להיות מתורבת במבחנה. EPCs מאוחרת-תולדה (סוף-EPCs) מופיעים לאחר 2-3 שבועות של תרבות. תאים אלה משולבים מהר לתוך monolayer של בתאי האנדותל וריד אדם הטבור והוא יכול ליצור צינורות נימי 19. חוץ מזה, מה שנקרא "מוקדם EPCs" לזרום בדם במשך כשבוע ולפעול בצורה פסיבית יותר באמצעות מולקולות angiogenic ומספק, כגון צמיחה אנדותל כלי הדםגורם (VEGF), או CXCL8 19. חולים עם מחלת עורקים כליליים (CAD) הראו כמויות נמוכות משמעותית של מוקדם EPCs בהשוואה לקבוצת ביקורת ללא CAD 20. מעניין לציין, כי אותה הקבוצה הראתה כמויות גדולות יותר של EPCs מאוחר בהשוואה לקבוצת ביקורת. מחקר אחר הראה כי מוקדם EPCs להגן EPCs הבדיל מן אפופטוזיס בתנאים חמצוני באופן paracrine 6. לכן, EPCs מוקדם עשוי לספק השפעות מגנות רלוונטיות באמצעות ההגירה של תאים אחרים בצורה וקישוט רכב או paracrine בתוך הדם ההיקפי.
פרוטוקול זה מתאר שיטה לטהר מוקדם EPCs על ידי הבידוד הראשון-שבריר PBMC מדם היקפי אדם ובהמשך לבודד CD34 + תאים מן-שבריר PBMC כדי לנקות השעית תא זה תאים לא רצויים. CD34 הוא סמן, המשמש לבידוד של תאי גזע hematopoietic אדם 9 </sup>. לאחר מכן, CD34 + תאים בתרבית על משטחים בתרבית רקמה מצופה פיברונקטין. אחרי שלושה ימים, את המדיום משתנה, ובכך לאבד את כל התאים שאינם חסידים. לבסוף, EPCs מבודד מגואלות לאמת את הספיגה של acLDL ואת הנוכחות של KDR כמו אנדותל תא סמן באמצעות תא קרינת מיון מופעל (FACS). כסמן נוסף, ניתחנו מולקולה הידבקות התא טסיות האנדותל (PECAM-1, CD31), אשר מתרחשת גם על תאי האנדותל.
שיקום של רקמת שריר הלב פגום או אוטם ידי גיוס משופרת של EPCs שייך אסטרטגיות טיפול נחקר באינטנסיביות במחלות לב וכלי דם. עם זאת, התרגום של תוצאות ניסוי לתוך פרקטיקה קלינית עדיין מאתגר, בהתחשב הגומלין הסלולר מורכב בגוף האדם במהלך תנאי pathophysiological שונים. יתר על כן, אני הלבבי / פציעות R לעורר הפרשת יתר של ציטוקינים שונים, הורמוני fac הצמיחה tors, השולט על הביות של EPCs לאזורים של היווצרות כלי דם 13. כפי שמוצגות, CXCL8, סטרומה תא הנגזרות 1α גורם (SDF-1α, CXCL12), VEGF גורם מעכבות הגירה מקרופאג (MIF) עולה במידה ניכרת בדגימות הבא אני לבבי / R פציעה 1. בין גורמים אלה, MIF הוא ציטוקין pleiotropic chemokine דמוי עם מאפיינים פרו-דלקתיים בעיקרה. בניגוד השם ההיסטורי שלה, MIF יש פונקציות פרו-נודדות, מתנהג כמו chemokine נכון על סוגי תאים שונים 1, 21, 22. MIF בתיווך תהליכי גיוס תא קושרו אל CXCR2 קולטנים chemokine ו CXCR4, אשר MIF נקשר, ומפעיל באופן שאינו מאותו מקור 21. מן הראוי לציין כי EPCs מבטאות הן של קולטנים אלה על פני השטח שלהם, אשר בנוסף להיות למעלה מוסדר בתנאים היפוקסיהתחת = "Xref"> 23, 24. יתר על כן, הראיות המצטברות עולה כי יש MIF השפעה קרדיו-מגן הכוללת במהלך I / R פציעה של הלב 22, 25, 26. בהקשר זה, מוכיח עוד כי MIF עשוי לתמוך נאווסקולריזציה במהלך מתח היפוקסי חשוב ורלוונטי במיוחד, כאשר בוחנים את מנגנוני התאוששות המוגבלים של שריר הלב הפגוע 27. מחקרים קודמים במבחנה וניסויים בעכברי מודל הפרה-קליני ספקו ראיות ראשונות על תפקידו של MIF ב EPCs גיוס 4. ראוי לציין, MIF גם הוא חלבון מטען בולט של EPCs העשויים להתפרסם במהלך גיוס EPCs בתוך אתרים איסכמי 28. עם זאת, מחקרים במסגרות קליניות בפרט בהשוואה אחר (אנגיוגנזה) ציטוקינים בסרום להישאר חמקמקים.
Protocol
Representative Results
Discussion
החלק הראשון של מחקר כלל את הבידוד של EPCs אדם מהדם ההיקפי של מתנדבים בריאים כדי לאפשר הערכה מקיפה של הדם של חולים לאחר ניתוח לב. לכן, צנטריפוגה שיפוע צפיפות בוצעה על מנת להפריד את החלק היחסי PBMC מפלסמה, גרנולוציטים ו אריתרוציטים. כדי להסיר ביותר של טסיות זיהום, שבריר התא ה…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
יש המחברים לא בתודות.
Materials
| Fibronectin | Biochrom AG | L7117 | Coating of T-75 flasks |
| Aqua ad iniectabilia | Fresenius Kabi | ||
| Endothelial cell growth medium MV2 | Promo Cell | C-22221 | |
| Endothelial cell growth medium MV2 SupplementMix | Promo Cell | C-39226 | |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | Density centrifugation |
| EasySep human CD34 positive Selection Kit | Stemcell Technologies | 18056 | Isolation of CD34+ cells |
| EasySep magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | Detachment of cells |
| Corning HTS transwell 96 well permeable supports | Sigma-Aldrich | CLS3387-8EA | Migration system |
| Hoechst solution | ThermoFisher | 33342 | Staining of migrated cells |
| ImageJ | National institutes of health | xxx | Counting of migrated cells |
Referenzen
- Emontzpohl, C., et al. Key role of MIF in the migration of endothelial progenitor cells in patients during cardiac surgery. Int J Cardiol. 181C, 284-287 (2014).
- Smadja, D. M., et al. Interleukin 8 is differently expressed and modulated by PAR-1 activation in early and late endothelial progenitor cells. J Cell Mol Med. 13 (8B), 2534-2546 (2009).
- Asahara, T., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275 (5302), 964-967 (1997).
- Simons, D., et al. Hypoxia-induced endothelial secretion of macrophage migration inhibitory factor and role in endothelial progenitor cell recruitment. J Cell Mol Med. 15 (3), 668-678 (2011).
- Dernbach, E., et al. Antioxidative stress-associated genes in circulating progenitor cells: evidence for enhanced resistance against oxidative stress. Blood. 104 (12), 3591-3597 (2004).
- Yang, Z., et al. Paracrine factors secreted by endothelial progenitor cells prevent oxidative stress-induced apoptosis of mature endothelial cells. Atherosclerosis. 211 (1), 103-109 (2010).
- Asahara, T., Kawamoto, A., Masuda, H. Concise review: Circulating endothelial progenitor cells for vascular medicine. Stem Cells. 29 (11), 1650-1655 (2011).
- Schmidt-Lucke, C., et al. Reduced number of circulating endothelial progenitor cells predicts future cardiovascular events: proof of concept for the clinical importance of endogenous vascular repair. Circulation. 111 (22), 2981-2987 (2005).
- Yoder, M. C. Human endothelial progenitor cells. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), a006692 (2012).
- Ito, H., et al. Endothelial progenitor cells as putative targets for angiostatin. Cancer Res. 59 (23), 5875-5877 (1999).
- Hill, J. M., et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. N Engl J Med. 348 (7), 593-600 (2003).
- Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
- Rohde, E., et al. Blood monocytes mimic endothelial progenitor cells. Stem Cells. 24 (2), 357-367 (2006).
- Rohde, E., et al. Immune cells mimic the morphology of endothelial progenitor colonies in vitro. Stem Cells. 25 (7), 1746-1752 (2007).
- Prokopi, M., et al. Proteomic analysis reveals presence of platelet microparticles in endothelial progenitor cell cultures. Blood. 114 (3), 723-732 (2009).
- Voyta, J. C., Via, D. P., Butterfield, C. E., Zetter, B. R. Identification and isolation of endothelial cells based on their increased uptake of acetylated-low density lipoprotein. J Cell Biol. 99 (6), 2034-2040 (1984).
- Koch, S., Claesson-Welsh, L. Signal transduction by vascular endothelial growth factor receptors. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), a006502 (2012).
- Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (9), 1584-1595 (2008).
- Hur, J., et al. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (2), 288-293 (2004).
- Tagawa, S., et al. Determination of Early and Late Endothelial Progenitor Cells in Peripheral Circulation and Their Clinical Association with Coronary Artery Disease. Int J Vasc Med. , 2015 (2015).
- Bernhagen, J., et al. MIF is a noncognate ligand of CXC chemokine receptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment. Nat Med. 13 (5), 587-596 (2007).
- Stoppe, C., et al. Interaction of MIF Family Proteins in Myocardial Ischemia/Reperfusion Damage and Their Influence on Clinical Outcome of Cardiac Surgery Patients. Antioxid Redox Signal. 23 (11), 865-879 (2015).
- Kanzler, I., et al. Differential roles of angiogenic chemokines in endothelial progenitor cell-induced angiogenesis. Basic Res Cardiol. 108 (1), 310 (2013).
- Walenta, K. L., Bettink, S., Bohm, M., Friedrich, E. B. Differential chemokine receptor expression regulates functional specialization of endothelial progenitor cell subpopulations. Basic Res Cardiol. 106 (2), 299-305 (2011).
- Rassaf, T., Weber, C., Bernhagen, J. Macrophage migration inhibitory factor in myocardial ischaemia/reperfusion injury. Cardiovasc Res. 102 (2), 321-328 (2014).
- Stoppe, C., et al. High postoperative blood levels of macrophage migration inhibitory factor are associated with less organ dysfunction in patients after cardiac surgery. Mol Med. 18, 843-850 (2012).
- Amin, M. A., et al. Migration inhibitory factor mediates angiogenesis via mitogen-activated protein kinase and phosphatidylinositol kinase. Circ Res. 93 (4), 321-329 (2003).
- Kupatt, C., et al. Embryonic endothelial progenitor cells expressing a broad range of proangiogenic and remodeling factors enhance vascularization and tissue recovery in acute and chronic ischemia. FASEB J. 19 (11), 1576-1578 (2005).
- Colotta, F., et al. Expression of a monocyte chemotactic cytokine by human mononuclear phagocytes. J Immunol. 148 (3), 760-765 (1992).
- Casale, T. B., Kaliner, M. A rapid method for isolation of human mononuclear cells free of significant platelet contamination. J Immunol Methods. 55 (3), 347-353 (1982).
- Lewandowska, K., Kaplan, D., Husel, W. CD34 expression on platelets. Platelets. 14 (2), 83-87 (2003).
- Stellos, K., et al. Platelet-derived stromal cell-derived factor-1 regulates adhesion and promotes differentiation of human CD34+ cells to endothelial progenitor cells. Circulation. 117 (2), 206-215 (2008).
- Thornton, M. A., Poncz, M. In vitro expansion of megakaryocytes from peripheral blood hematopoietic progenitors. Methods Mol Med. 31, 337-345 (1999).
- Ivetic, N., et al. Producing megakaryocytes from a human peripheral blood source. Transfusion. 56 (5), 1066-1074 (2016).
- Friedrich, E. B., Walenta, K., Scharlau, J., Nickenig, G., Werner, N. CD34-/CD133+/VEGFR-2+ endothelial progenitor cell subpopulation with potent vasoregenerative capacities. Circ Res. 98 (3), e20-e25 (2006).
- Wijelath, E. S., et al. Novel vascular endothelial growth factor binding domains of fibronectin enhance vascular endothelial growth factor biological activity. Circ Res. 91 (1), 25-31 (2002).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Yao, E. H., et al. Effects of the antioxidative beta-blocker celiprolol on endothelial progenitor cells in hypertensive rats. Am J Hypertens. 21 (9), 1062-1068 (2008).
- Takahashi, T., et al. Ischemia- and cytokine-induced mobilization of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for neovascularization. Nat Med. 5 (4), 434-438 (1999).
- Kawamoto, A., et al. Therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for myocardial ischemia. Circulation. 103 (5), 634-637 (2001).
- Kim, B. S., et al. Myocardial Ischemia Induces SDF-1alpha Release in Cardiac Surgery Patients. J Cardiovasc Transl Res. 9 (3), 230-238 (2016).
- Frangogiannis, N. G., Smith, C. W., Entman, M. L. The inflammatory response in myocardial infarction. Cardiovasc Res. 53 (1), 31-47 (2002).
- Zernecke, A., Bernhagen, J., Weber, C. Macrophage migration inhibitory factor in cardiovascular disease. Circulation. 117 (12), 1594-1602 (2008).
- White, D. A., et al. Pro-inflammatory action of MIF in acute myocardial infarction via activation of peripheral blood mononuclear cells. PLoS One. 8 (10), e76206 (2013).
