L'agrégation magnétique de cellules souches 3D et bioréacteurs Maturation pour Cartilage régénération
Summary
Chondrogenèse de cellules souches nécessite un réglage fin des conditions de culture. Nous présentons ici une approche magnétique pour les cellules de condensation, une étape essentielle pour initier chondrogenèse. De plus, nous montrons que la maturation dynamique dans un bioréacteur applique une stimulation mécanique aux constructions cellulaires et améliore la production de la matrice extracellulaire cartilagineuse.
Abstract
Ingénierie Cartilage reste un défi en raison des difficultés à créer un implant fonctionnel in vitro similaire au tissu natif. Une approche récemment exploré pour le développement de substituts autologues implique la différenciation des cellules souches en chondrocytes. Pour lancer ce chondrogenèse, un degré de compactage des cellules souches est nécessaire; Par conséquent, nous avons démontré la faisabilité de cellules magnétiquement à condensation, à l'intérieur des échafaudages épais et sans échafaudage, en utilisant des sources de champ magnétique miniaturisé attracteurs cellulaires. Cette approche magnétique a également été utilisé pour guider la fusion globale et de construire sans échafaudage, organisé, en trois dimensions (3D) tissus de plusieurs millimètres en taille. En plus d'avoir une taille accrue, le tissu formé par fusion à entraînement magnétique a présenté une augmentation significative de l'expression du collagène II, et on a observé une tendance similaire pour l'expression de l'aggrécane. Comme le cartilage natif a été soumis à des forces tchapeau influencé sa structure 3D, la maturation dynamique a également été réalisée. Un bioréacteur qui fournit des stimuli mécaniques a été utilisé pour la culture des échafauds magnétique ensemencés sur une période de 21 jours. maturation des bioréacteurs largement améliorée chondrogenèse dans les échafauds cellularisées; la matrice extracellulaire obtenue dans ces conditions a été riche en collagène de type II et aggrécane. Ce travail présente le potentiel d'innovation de la condensation magnétique des cellules souches marquées et la maturation dynamique dans un bioréacteur pour une meilleure différenciation chondrogénique, les deux sans échafaudage et à l'intérieur de polysaccharide échafauds.
Introduction
Les nanoparticules magnétiques sont déjà utilisés dans la clinique comme agents de contraste pour l'imagerie par résonance magnétique (IRM), et leurs applications thérapeutiques garder en expansion. Par exemple, il a récemment été démontré que les cellules marquées peuvent être manipulées in vivo en utilisant un champ magnétique externe et peuvent être dirigées et / ou maintenues à un site défini d'implantation 1, 2, 3. Dans la médecine régénérative, ils peuvent être utilisés pour concevoir des tissus organisés in vitro 4, y compris le tissu vasculaire 5, 6, 7, 8 os, cartilage et 9.
Le cartilage articulaire est immergé dans un environnement aseptique, ce qui rend la réparation des composants de la matrice extracellulaire sont très limitées lorsque les dommages se produisent. Pour cette raison, recherch se concentre actuellement sur l'ingénierie des remplacements de cartilage hyalin qui peuvent être implantés sur le site de défaut. Afin de produire un remplacement autologue, certains groupes de recherche étudient l'utilisation de chondrocytes autologues en tant que source de cellules 10, 11, tandis que d' autres mettent l' accent sur la capacité des cellules souches mésenchymateuses (MSC) de se différencier en chondrocytes 12, 13. Dans des études antérieures récapitulés ici, nous avons choisi MSC, comme prélèvement de moelle osseuse est assez simple et ne nécessite pas le sacrifice de chondrocytes en bonne santé, qui risquent de perdre leur phénotype 14.
Une première étape essentielle pour initier la différenciation chondrogénique des cellules souches est leur condensation. Les agrégats cellulaires sont couramment formés en utilisant soit la centrifugation ou la culture de Micromass 15; Cependant, ces procédés de condensation neither présenter le potentiel de créer des agrégats de cellules à l'intérieur des échafaudages d'épaisseur, ni la possibilité de contrôler la fusion des agrégats. Dans cet article, nous décrivons une approche novatrice de condensation des cellules souches en utilisant un marquage magnétique MSC et attraction magnétique. Cette technique a été prouvée pour former des constructions 3D sans échafaudage par l' intermédiaire de la fusion des agrégats avec l'autre pour obtenir un tissu cartilagineux échelle millimétrique 9. ensemencement magnétique de échafauds épais et grand a également permis la possibilité d'augmenter la taille du tissu d'ingénierie, la conception d'une forme plus facilement utile pour l'implantation et la diversification du potentiel pour les applications cliniques de réparation du cartilage. Ici, nous détaillons le protocole pour l'ensemencement magnétique du MSC en supports poreux constitués de polysaccharides naturels, le pullulane et le dextrane, les échafaudages précédemment utilisé pour confiner des cellules souches 16, 17. la différenciation chondrogénique était finally effectuée dans un bioréacteur pour assurer la diffusion des éléments nutritifs et de gaz en continu dans le noyau de la matrice des échafaudages ensemencés avec une densité élevée de cellules. En plus de fournir des éléments nutritifs, les facteurs de croissance chondrogéniques, et le gaz aux cellules, le bioréacteur a offert la stimulation mécanique. Dans l'ensemble, la technologie magnétique pour confiner les cellules souches, combinée à la maturation dynamique dans un bioréacteur, peut améliorer considérablement la différenciation chondrogénique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tout d'abord, parce que les techniques présentées ici reposent sur l'intériorisation de nanoparticules magnétiques, une question importante est le résultat des nanoparticules une fois qu'ils se localisent dans les cellules. Il est vrai que les nanoparticules de fer peuvent déclencher une toxicité potentielle ou la capacité de différenciation réduite en fonction de leur taille, le revêtement et le temps d'exposition 19, 22. Cependant, p…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier QuinXell Technologies et CellD, en particulier Lothar Grannemann et Dominique Ghozlan pour leur aide dans le bioréacteur. Nous remercions Catherine Le Visage, qui nous a fourni les échafauds de polysaccharide pullulane / dextran. Ce travail a été soutenu par l'Union européenne (projet ERC-2014-cog MATISSE 648779) et par le AgenceNationalede la Recherche (ANR), France (projet ANR-11 MagStem SVSE5).
Materials
| Iron oxide (maghemite) nanoparticules ( γ-Fe2O3) | PHENIX – University Paris 6 | Made and given by C. Ménager | Mean diameter of 8.1 nm and negative surface charge |
| Polysaccharide Pullulan/Dextran scaffolds | LIOAD – University Nantes | Made and given by C. Le Visage | Prepared from a 75:25 mixture of pullulan/dextran in alkaline conditions (10M NaOH). Porosity: 185-205µm; Thickness: 7mm; Surface area: 1.8cm2. |
| TisXell Regeneration System | QuinXell Technologies | QX900-002 | Biaxial bioreactor with 500 mL culture chamber |
| Cage for scaffolds: Histosette II M492 | VWR | 720-0909 | |
| Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | Three independant batches have been used |
| MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
| DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| Sodium pyruvate solution 100mM | Sigma | S8636 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare the concentrated solution (25 mM) in distilled water extemporaneously |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare the 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare the 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20°C |
| TGF-beta 3 protein 10µg | Interchim | 30R-AT028 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare the 1M stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Pullulanase from Bacillus acidopullulyticus | Sigma | P2986 | |
| Dextranase from Chaetomium erraticum | Sigma | D0443 | |
| NucleoSpin RNA Extraction Kit | Macherey-Nagel | 740955.5 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| Random Primer – Hexamer | Promega | C1181 | 500 µg/mL: Use diluted 1/2 and put 1 µL per sample |
| Recombinant RNAsin ribonuclease inhibitor | Promega | N2511 | 40 U/µL: put 1 µL per sample |
| PCR nucleotide dNTP mix (10mM each) | Roche | 10842321 | |
| SyBr Green PCR Master Mix | Life Technologies | 4368708 | |
| Step One Plus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4381792 | |
| Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
| OCT solution | VWR | 361603E | |
| Isopentane | Sigma | M32631 | |
| Toluidine blue O | VWR | 1.15930.0025 | |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Toluene | VWR | 1.08323.1000 | |
| Mounting medium Pertex | Histolab | 840 | |
| RPLP0 Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3' ; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3' |
|
| Aggrecan Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3' ; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5' | |
| Collagen II Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3' ; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5' |
Referenzen
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