ניתוח של הפרדת כרומוזום, אצטון היסטון, ומורפולוגיה ציר ב סוס ביציות
Summary
כתב יד זה מתאר גישה ניסיונית מורפולוגית וביוכימית לאפיין ביציות סוסים. באופן ספציפי, העבודה הנוכחית מדגימה כיצד לאסוף ביציות של בוגר בוגרת ובוגרת על ידי אולטראסאונד מונחה איסוף ביצית (OPU) וכיצד לחקור הפרדה כרומוזום, מורפולוגיה ציר, acetylation היסטון גלובלי, ביטוי mRNA.
Abstract
השדה של רבייה בסיוע פותחה לטיפול בבעיות פוריות אצל נשים, חיות נלוות וסוגים הנמצאים בסכנת הכחדה. בסוס, רבייה מסייעת גם מאפשר ייצור של עוברי מן ביצועים גבוהים בלי להפריע את הקריירה הספורטית שלהם תורמת לעלייה במספר הסייחים ממאדים של ערך גנטי גבוה. כתב היד הנוכחי מתאר את הנהלים המשמשים לאיסוף ביציות בוגר ו בוגר מן השחלות באמצעות ביצית איסוף (OPU). ביציות אלה שימשו אז כדי לחקור את השכיחות של aneuploidy על ידי התאמת פרוטוקול שפותח בעבר בעכברים. באופן ספציפי, הכרומוזומים ואת centromeres של הביציות metaphase II (MII) היו תווית fluorescently ונספר על תוכניות מוקד רציף לאחר מיקרוסקופ לייזר confocal סריקה. ניתוח זה גילה שכיחות גבוהה יותר בשיעור aneuploidy כאשר ביציות בוגרים נאספו הזקיקים והתבגר במבחנה לעומתIn vivo. Immunostaining עבור tubulin ואת הצורה acetylated של היסטון ארבע בשאריות lysine ספציפיים חשף גם הבדלים במורפולוגיה של ציר מיוטי ובתבנית הגלובלית של אצטילציה היסטון. לבסוף, הביטוי של mRNAs קידוד עבור היסטון deacetylases (HDACs) ו acetyl- העברות (HATs) נחקר על ידי שעתוק לאחור quantitative-PCR (q-PCR). לא נמצאו הבדלים בביטוי היחסי של התמלילים שנצפו בין המבחנה לבין הביציות המתבגרות של vivo . בהסכמה עם השתקה כללית של פעילות תמליל במהלך התבגרות הביציות, הניתוח של כמות התמליל הכולל יכול רק לחשוף יציבות mRNA או השפלה. לכן, ממצאים אלה מצביעים על כך שתקנות טרנסלציוניות ופוסט-טרנסלציוניות נוספות עשויות להיות מושפעות.
בסך הכל, המחקר הנוכחי מתאר גישה ניסיונית מורפולוגית וביוכימית לאפיין את הביצית סוס, ceLl סוג זה מאתגר מאוד ללמוד בשל זמינות מדגם נמוך. עם זאת, הוא יכול להרחיב את הידע שלנו על ביולוגיה הרבייה ועקרות מינים monovulatory.
Introduction
מגוון רחב של טכניקות רבייה בסיוע פותח לטיפול בבעיות פוריות אצל נשים, חיות נלוות וסוגים הנמצאים בסכנת הכחדה. אחד ההליכים הנפוצים ביותר במסגרות קליניות הוא אחזור של ביציות הבמה metaphase II (MII) של זקיקי השחלות על ידי שאיפה transvaginal מונחה אולטרסאונד, איסוף ביצית (OPU) 1 . ביציות אלה מופרות אז במבחנה (IVF), עם העובר שנוצר (ים) מושתל ברחם הנמען. בשלב MII (בוגרת) ביציות מאוחזרים בעקבות ניהול של גונדוטרופינים אקסוגניים. עם זאת, טיפול זה קשור, בחלק מהחולים, עם התפתחות של תסמונת hyperstimulation השחלות (OHSS) 2 .
ניצול של היכולת המהותית של בוגרות, בוגרות בוגרת (שלב GV) כדי לחדש את המיוזה מיד לאחר מבודדים מן הזקיקים שלהם, ניתן להשיג ביציות בוגרות ללא adminisגונדוטרופין 3 . הליך זה נקרא ביצית במבחנה חוץ גופית (IVM) ומייצג גישה פחות סמים, פחות יקר, יותר ידידותי לסבלנות לסיוע טכנולוגיה הרבייה. עם זאת, ההצלחה של התפתחות העובר עם ביציות במבחנה מעובד הוא בדרך כלל נמוך יותר מאשר עם vivo התבגר vivo 4 , 5 . הסבר אפשרי הוא כי ביציות בוגרת מבחנה מושפעים יותר על ידי טעויות הפרדה כרומוזום, וכתוצאה מכך aneuploidy פוגעת התפתחות עובריים נורמלי 6 .
הבנת הבסיס המולקולרי של הפרעה מוטעית כרומוזומלית במהלך IVM תגלה בסופו של דבר את הפוטנציאל המלא של טכניקה זו. ברוח זו, הגישה הניסויית המשמשת לבדיקת התכונות המורפולוגיות והביוכימיות של ביציות במבחנה , בהשוואה ל vivo maturביציות אד כאן מתואר 7 , 8 . באופן ספציפי, את ההליכים עבור OPU של ביציות בשלים בוגרת IVM של ביציות בשלים מודגמים באמצעות סוסים בוגרים טבעי רכיבה כמודל ניסיוני. לאחר מכן, immunofluorescence וניתוח התמונה משמשים לחקור הפרדה כרומוזום, מורפולוגיה ציר, ואת דפוס העולמי של אצטילון היסטון על gametes אלה. לבסוף, פרוטוקול של שעתוק לאחור PCR כמותי מתואר לניתוח ביטוי mRNA.
בהשוואה למודלים של בעלי חיים מכרסמים, סוסים אינם מאפשרים מניפולציה גנטית, הם פחות קל לתמרן, ודורשים תחזוקה יקר. עם זאת, מודל זה הוא צובר עניין רב עבור המחקר של התבגרות הביצית 9 , 10 בשל הדמיון הפיזיולוגיה השחלות האדם 11 , 12 </ Sup>. יתר על כן, פיתוח של פרוטוקולים אמינים של IVM-IVF בסוס יש אינטרס כלכלי משמעותי, שכן זה יאפשר עלייה במספר הסוסים ממאדים של ערך גנטי גבוה.
אחת המגבלות של ביצוע ניסויים על ביציות, במיוחד במינים monovulatory, הוא זמינות מדגם מוגבל. מגבלה זו כבר התגבר כאן על ידי התאמת גישה, שפותחה בעבר בעכברים, כדי ביציות סוס 13 , 14 כדי לבצע ספירת כרומוזום כי ממזער את ההפסד המדגם (ראה דיון להשוואה עם טכניקות אחרות זמין). יתר על כן, פרוטוקול מכתים הקרינה משולשת כבר אופטימיזציה לבצע ניתוחים מרובים על המדגם אותו, וניתוח ה- Q-PCR בוצעו על בריכות של 2 ביציות בלבד.
בסך הכל, המחקר הנוכחי מתאר גישה ניסיונית שמטרתה מורפולוגית ביוכימית צ'הRacterize את הביצית סוס, סוג התא כי הוא מאתגר מאוד ללמוד בשל זמינות מדגם נמוך. עם זאת, הוא יכול להרחיב את הידע שלנו על ביולוגיה הרבייה ועקרות של מינים monovulatory.
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות IVM בוצעה בסוסים במשך יותר מ 20 שנים 16 , אנחנו עדיין לא יודעים אם הביצית יכולה להיות המקור של aneuploidy עובריים, כפי שהוצע עבור בני אדם 17 . הסיבה היא כנראה כי הכנת מתפשט הביצית עבור ספירת כרומוזום התוצאות להפסד מדגם ניכר. עם זאת, בסקר של שיטות המ…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים היו רוצים להודות Fabrice וינסנט לתמיכה עם לייזר סריקת מיקרוסקופיה confocal (LSCM) , ואת פיליפ Barrière ו תיירי בלארד לביצוע אולטרסאונד סריקה השחלה היומית וזריקה hCG. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי פרויקט "אזור Sardegna ו Regione Lombardia" "Ex Ovo Omnia" (מענק מס '26096200 ל AML); את "לוריאל איטליה עבור כל דון e la Scienza 2012" המלגה (חוזה 2012 ל FF), FP7-PEOPLE-2011- CIG, מחקר הסוכנות (REA) "Pro-Ovum" (מענק מס '303640 ל VL); ועל ידי בית הספר הפוסט-דוקטורט לחקלאות ולרפואה וטרינרית, במימון משותף של הקרן החברתית האירופית, תוכנית מבצעית סקטוריאלית לפיתוח משאבי אנוש 2007-2013 (חוזה מס 'POSDRU / 89 / 1.5 / S / 62371 ל- IM). אוסף הביציות של vivo מומן על ידי מכון המחקר של Cheval et de l'Equitation.
Materials
| ultrasound probe | Aloka | UST-5820-7,5 | |
| human chorionic gonadotrophin | centravet | CHO004 | 1500unit/animal IV |
| detomidine | centravet | MED010 | 9-15µg/kg IV |
| butylscopolamine bromure | centravet | EST001 | 0,2mg/kg IV |
| stereomicroscope | NIKON | SMZ-2B | |
| butorphanol | centravet | DOL003 | 10µg/kg IV |
| benzyl-penicillin | centravet | DEP203 IM | 15000UI/animal |
| TCM199 | Sigma-Aldrich | M3769 10X1L | powder for hepes-buffered TCM199 |
| Hepes sodium salt | Sigma-Aldrich | H3784-100G | |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| NaHCO3-buffered TCM199 | Sigma-Aldrich | M2154-500ML | liquid for IVM medium |
| epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E4127 | |
| newborn calf serum | Sigma-Aldrich | N4762-500ML | |
| 4-well dishes | NUNCLON | 144444 | |
| incubator | Heraeus | BB6060 | |
| monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | |
| hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| pronase | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich | 341584 | |
| triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| normal donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| rabbit anti-Aurora B phospho-Thr232 | BioLegend | 636102 | |
| TRITC-conjugated donkey anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | 711-025-152 | |
| Vecta-Shield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| YOPRO1 | Thermofisher Scientific | Y3603 | |
| confocal laser scanning microscope | LSM 780 | Zeiss | |
| confocal laser scanning microscope | LSM 700 | Zeiss | |
| ImageJ software | rsb.info. nih.gov/ij/download.html | free resource | |
| mouse anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T8203 | |
| rabbit anti-acH4K16 | Upstate Biotechnology | 07-329 | |
| AlexaFluor 488-coniugated donkey anti-mouse IgG | Life Technologies | A21202 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole | Sigma-Aldrich | D8417 | DAPI |
| centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| RNALater | Invitrogen | AM7020 | |
| Luciferase RNA | Promega | L4561 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| random hexamers | Thermofisher Scientific | N8080127 | |
| mouse Moloney leukaemia virus reverse transcriptase | Thermofisher Scientific | 28025013 | |
| SYBR green supermix | BioRad | 1708880 | |
| specific primers | Sigma-Aldrich | specific primers were designed using Primer3Plus software (free resource) | |
| thermal-cycler | BioRad | MyiQ | |
| mouse monoclonal anti-CENPA | Abcam | ab13939 | |
| mouse monoclonal anti-Aurora B | Abcam | ab3609 | |
Referenzen
- Dellenbach, P. Transvaginal, sonographically controlled ovarian follicle puncture for egg retrieval. Lancet. 1 (8392), 1467 (1984).
- Humaidan, P. Ovarian hyperstimulation syndrome: review and new classification criteria for reporting in clinical trials. Hum Reprod. , (2016).
- Pincus, G., Enzmann, E. V. The Comparative Behavior of Mammalian Eggs in Vivo and in Vitro : I. The Activation of Ovarian Eggs. J Exp Med. 62 (5), 665-675 (1935).
- Emery, B. R., Wilcox, A. L., Aoki, V. W., Peterson, C. M., Carrell, D. T. In vitro oocyte maturation and subsequent delayed fertilization is associated with increased embryo aneuploidy. Fertil Steril. 84 (4), 1027-1029 (2005).
- Nichols, S. M., Gierbolini, L., Gonzalez-Martinez, J. A., Bavister, B. D. Effects of in vitro maturation and age on oocyte quality in the rhesus macaque Macaca mulatta. Fertil Steril. 93 (5), 1591-1600 (2010).
- Requena, A. The impact of in-vitro maturation of oocytes on aneuploidy rate. Reprod Biomed Online. 18 (6), 777-783 (2009).
- Franciosi, F. In vitro maturation affects chromosome segregation, spindle morphology and acetylation of lysine 16 on histone H4 in horse oocytes. Reprod Fertil Dev. , (2015).
- Franciosi, F. Changes in histone H4 acetylation during in vivo versus in vitro maturation of equine oocytes. Mol Hum Reprod. 18 (5), 243-252 (2012).
- Choi, Y. H., Gibbons, J. R., Canesin, H. S., Hinrichs, K. Effect of medium variations (zinc supplementation during oocyte maturation, perifertilization pH, and embryo culture protein source) on equine embryo development after intracytoplasmic sperm injection. Theriogenology. , (2016).
- Hendriks, W. K. Maternal age and in vitro culture affect mitochondrial number and function in equine oocytes and embryos. Reprod Fertil Dev. 27 (6), 957-968 (2015).
- Carnevale, E. M. The mare model for follicular maturation and reproductive aging in the woman. Theriogenology. 69 (1), 23-30 (2008).
- Ginther, O. J. The mare: a 1000-pound guinea pig for study of the ovulatory follicular wave in women. Theriogenology. 77 (5), 818-828 (2012).
- Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes. Curr Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).
- Duncan, F. E., Chiang, T., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that a defective spindle assembly checkpoint is not the primary cause of maternal age-associated aneuploidy in mouse eggs. Biol Reprod. 81 (4), 768-776 (2009).
- Larionov, A., Krause, A., Miller, W. A standard curve based method for relative real time PCR data processing. BMC Bioinformatics. 6 (62), (2005).
- Choi, Y. H., Hochi, S., Braun, J., Sato, K., Oguri, N. In vitro maturation of equine oocytes collected by follicle aspiration and by the slicing of ovaries. Theriogenology. 40 (5), 959-966 (1993).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Akiyama, T., Nagata, M., Aoki, F. Inadequate histone deacetylation during oocyte meiosis causes aneuploidy and embryo death in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7339-7344 (2006).
- Homer, H. A. Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes. Genes Dev. 19 (2), 202-207 (2005).
- Rambags, B. P. Numerical chromosomal abnormalities in equine embryos produced in vivo and in vitro. Mol Reprod Dev. 72 (1), 77-87 (2005).
- Nabti, I., Marangos, P., Bormann, J., Kudo, N. R., Carroll, J. Dual-mode regulation of the APC/C by CDK1 and MAPK controls meiosis I progression and fidelity. J Cell Biol. 204 (6), 891-900 (2014).
- Shomper, M., Lappa, C., FitzHarris, G. Kinetochore microtubule establishment is defective in oocytes from aged mice. Cell Cycle. 13 (7), 1171-1179 (2014).
- Luzzo, K. M. High fat diet induced developmental defects in the mouse: oocyte meiotic aneuploidy and fetal growth retardation/brain defects. PLoS One. 7 (11), e49217 (2012).
- Ma, P., Schultz, R. M. Histone deacetylase 2 (HDAC2) regulates chromosome segregation and kinetochore function via H4K16 deacetylation during oocyte maturation in mouse. PLoS Genet. 9 (3), e1003377 (2013).
- Yang, F., Baumann, C., Viveiros, M. M., De La Fuente, R. Histone hyperacetylation during meiosis interferes with large-scale chromatin remodeling, axial chromatid condensation and sister chromatid separation in the mammalian oocyte. Int J Dev Biol. 56 (10-12), 889-899 (2012).
- Luciano, A. M. Oocytes isolated from dairy cows with reduced ovarian reserve have a high frequency of aneuploidy and alterations in the localization of progesterone receptor membrane component 1 and aurora kinase B. Biol Reprod. 88 (3), 58 (2013).
- Luciano, A. M., Lodde, V., Franciosi, F., Ceciliani, F., Peluso, J. J. Progesterone receptor membrane component 1 expression and putative function in bovine oocyte maturation, fertilization, and early embryonic development. Reproduction. 140 (5), 663-672 (2010).
- Terzaghi, L. PGRMC1 participates in late events of bovine granulosa cells mitosis and oocyte meiosis. Cell Cycle. , 1-14 (2016).
- Susor, A., Jansova, D., Anger, M., Kubelka, M. Translation in the mammalian oocyte in space and time. Cell Tissue Res. 363 (1), 69-84 (2016).
- Chen, J. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes Dev. 25 (7), 755-766 (2011).
- Ma, J., Flemr, M., Strnad, H., Svoboda, P., Schultz, R. M. Maternally recruited DCP1A and DCP2 contribute to messenger RNA degradation during oocyte maturation and genome activation in mouse. Biol Reprod. 88 (1), 11 (2013).
