Cinetica di Lagging filamento sintesi del DNA<em> In Vitro</em> Dai replica proteine batteriofago T7
Summary
We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.
Abstract
Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.
Introduction
La replicazione del DNA è una caratteristica conservato di tutta la vita cellulare. Mentre l'identità e il numero dei componenti di replica variano ampiamente, i meccanismi generali sono condivisi tra evoluzione 1. Qui, descriviamo gel a base, discontinue esperimenti cinetici, utilizzando substrati radioattivi, volti a comprendere la cinetica della sintesi del DNA in ritardo filamento in vitro da componenti del replisoma T7. Il meccanismo di replicazione del batteriofago T7 è molto semplice, composto da soli quattro proteine (la DNA polimerasi, GP5, e il suo fattore processività, E. coli tioredossina, le bifunzionali GP4 primasi-elicasi, e la proteina legante il DNA a singolo filamento, GP2. 5) 2. Questa caratteristica lo rende un sistema interessante modello per studiare i meccanismi conservati biochimici coinvolti nella replicazione del DNA.
Particolare enfasi è posta sulla formazione di primer ribonucleotide da T7 DNA primasi, una critical passo per l'inizio della sintesi del DNA. Inoltre, si può anche esaminare l'utilizzo di questi primer di polimerasi T7 DNA o altre proteine di replica includendoli nella miscela di reazione. Il T7 primasi-elicasi, GP4, catalizza la formazione di primer per la sintesi del DNA a specifiche sequenze di DNA chiamati siti di riconoscimento primasi, o PRS, (5'-GTC-3 '). La citosina nel PRS è criptico, è essenziale per il riconoscimento del sito, ma non viene copiato nel prodotto 3. Il primo passo nella sintesi di primer da gp4 comporta la formazione del dinucleotide pppAC, che viene poi estesi ad un trimero, ed eventualmente primers tetranucleotide funzionali pppACCC, pppACCA o pppACAC seconda della sequenza nel modello 4. Questi primer possono essere utilizzati da polimerasi T7 DNA per iniziare la sintesi di DNA, che è anche un processo gp4 assistito 5, 6. A questo proposito, il primasidominio stabilizza i brevissimi tetraribonucleotides con il modello, impedendo loro di dissociazione, si impegna DNA polimerasi in maniera atta a garantire il primer / modello nel polimerasi sito attivo 7. Questi passaggi (RNA sintesi di primer, primer per handoff polimerasi, ed estensione) si ripetono in cicli multipli di replicare il filamento in ritardo e devono essere coordinati con la replicazione del filamento principale.
I saggi descritti qui sono altamente sensibili e possono essere eseguite in tempi moderata. Tuttavia, essi sono relativamente bassi-throughput e grande cura deve essere esercitata in uso e lo smaltimento dei materiali radioattivi. A seconda della velocità con cui la reazione procede, si potrebbe impiegare uno strumento rapido raffreddamento per ottenere campioni su scale temporali suscettibili per un'analisi significativa degli insegnamenti tempo di reazione sia stazionario o lo stato pre-stazionario. Recentemente, abbiamo usato saggi descritti qui per fornire evidence dell'importanza del rilascio primer dominio primasi del gp4 nell'avvio di frammenti di Okazaki. Inoltre, abbiamo trovato prove di un ruolo di regolamentazione per il T7 DNA a singolo filamento di proteine, gp2.5 vincolante, nel promuovere la formazione di primer efficiente e l'utilizzo 8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il fattore più importante nel realizzare questi esperimenti è la disponibilità di enzima purificato altamente attiva. Durante il lavoro con GP4, per esempio, abbiamo scoperto che la memorizzazione dell'enzima purificato in tampone (20 mM fosfato di potassio, pH 7,4, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT) contenente 50% glicerolo a -20 ° C porta ad una riduzione l'attività specifica del preparato nell'arco di pochi mesi. Pertanto ora flash congelamento piccole aliquote di gp4 purificato in 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank C.C.R. laboratory members for comments and S. Moskowitz for figure preparation. This work was supported by National Institutes of Health Grants F32GM101761 (A.J.H.) and GM54397 (C.C.R.).
Materials
Tris pre-set crystals pH 7.5 |
SIGMA | T4128 | |
| Tris base | SIGMA | 93362 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | SIGMA | G1501 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Mallinckrodt Chemicals | 5958-04 | |
| 1,4-Dithiothreitol | J.T. Baker | F780-02 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | MP Biomedicals | 811030 | |
| (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate | Mallinckrodt Chemicals | 4931-04 | |
| [α-32P] CTP | PerkinElmer | BLU508H | radioactive, take protective measures |
| [γ-32P] ATP | PerkinElmer | BLU502A | radioactive, take protective measures |
| 100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Affymetrix | 77100 | four dNTPs part of set |
| 100 mM ATP and CTP | Epicentre | RN02825 | part of NTP set |
| ssDNA constructs | Integrated DNA Technologies | N/A | custom sequences |
| methanol | Macron Fine Chemicals | 3017-08 | |
| formamide | Thermo Scientific | 17899 | |
| bromophenol blue | SIGMA | B8026 | |
| cylene xyanol | SIGMA | X4126 | |
| acrylamide | SIGMA | A9099 | Toxic |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | SIGMA | M7279 | Toxic |
| Urea | Boston Bioproducts | P-940 | |
| Boric acid | Mallinckrodt Chemicals | 2549 | |
| Rapid Quench-Flow Instrument | Kintek Corp. | RQF-3 | |
| Kintek Explorer | Kintek Corp. | N/A | |
| Kaleidagraph | Synergy Software | N/A |
Referenzen
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