二つの画像解析アルゴリズム、「 ショウジョウバエ NMJ形態計測」および「 ショウジョウバエ NMJブートン形態計測を」自動的ショウジョウバエ神経筋接合部(NMJ)の9つの形態学的特徴を定量化するために、 作成されました 。
シナプスの形態は、シナプス伝達効率に緊密に関連しており、多くの場合、形態学的シナプスの欠陥は、最終的にシナプス機能不全につながります。 ショウジョウバエ幼虫神経筋接合部(NMJ)、グルタミン酸作動性シナプスのための十分に確立されたモデルは、広範囲に数十年にわたって研究されてきました。 NMJの形態学的欠陥を引き起こす変異の同定は、シナプスの発達および機能を調節する遺伝子のレパートリーを明らかにしました。これらの多くは、 ショウジョウバエ NMJの形態異常を検出するための定性的なアプローチに焦点を当てた大規模な研究で同定されました。定性分析の欠点は、NMJの形態に貢献し、多くの微妙な選手がそう見過ごされたままということです。定量分析は、微妙な形態学的差異を検出するために必要とされるのに対し、彼らが面倒であるため、このような分析はまだ一般的に行われていません。このプロトコルは、「詳細にショウジョウバエ 2つの画像分析アルゴリズムを説明します</emフィジー互換マクロとして入手> NMJ形態計測」および『 ショウジョウバエ NMJブートン形態計測』、 ショウジョウバエ NMJの、定量的な正確かつ客観的形態計測分析のために。この方法は、一般的に使用されるマーカーはDlg-1で免疫NMJ端子を分析するために開発されBRPさらに、例えばHRP、CSPとSYTなどの他のマーカーへの広い適用は、このプロトコルで提示されているマクロは、9つの形態学的NMJの機能を評価することができる:NMJ面積、NMJ境界、終末の数、NMJ長、NMJ最長分岐長さ、島の数、分岐の数、分岐点及びNMJ端子にアクティブなゾーンの数の数。
このような知的障害、自閉症スペクトラム障害と統合失調症の認知障害は、しばしば異常なシナプス機能1、2、3によって特徴付けられます。シナプスの形態および機能がしっかり絡み合っています。形態学的欠陥は、シナプス機能不全を引き起こす可能性があり、逆に、異常なシナプス伝達は、シナプスの成熟および形態4、5、6に影響を与えます。
モデル生物の数は、よりよいシナプス生物学を理解し、シナプスの変化が健康と病気7、8、9での脳機能にどのように影響するかに光を当てるために使用されてきました。 ショウジョウバエ NMJはグルタミン酸SYのために広く研究およびin vivoモデルで十分に確立されていますnapse生物学10、11。過去数十年間では、このモデルはのNMJ間の形態学的な差を検出する目的で、だけでなく、大規模な遺伝子スクリーニングのために、生理学的および遺伝子に焦点を当てた研究のために使用されてきました。具体的には、フォワード遺伝子スクリーニングは、シナプスの開発の根底にある多くの重要な調節因子および機構を特定し12、13、14、15、16として機能しています。しかしながら、これらの画面のほとんどはNMJ端子形態の視覚的評価に及び定性的なシナプスの異常の検出または少数形態学的特徴の半定量的スコアに依存していました。その結果、人間の目には非自明ではなく、微妙なシナプスの形態異常を見逃しやすいです。総合的に定量的な差を検出できるようにするために、NMJは正確に関心の形態学的パラメータを系統的に定量化して評価する必要があります。手動NMJの機能を測定することは、いくつかのNMJ関心の特徴および/または大規模な遺伝的スクリーニングを実行するときがある場合は特に、面倒です。マルチパラメトリック、ハイスループット形態素解析をサポートするため、客観定量化を達成するために、2つのマクロ「 ショウジョウバエ NMJ形態計測」と「 ショウジョウバエ NMJブトン形態計測は、」17を開発しました。両方のマクロは、オープンソースの画像解析ソフトウェアフィジー18で実行され、共焦点および非共画像の両方を定量化することができます。
「ショウジョウバエ NMJ形態計測」対策後シナプスマーカーディスク大-1(はDlg-1)又はシナプス前西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)で免疫染色NMJ端子、アクティブゾーンマーカーbruchpilot(BRP)で同時標識しました。これは、9形態学的parameを定量化TERS(さらに後述する):NMJ面積、NMJ境界、終末の数、NMJ長、NMJ最長枝長、島の数、分岐の数、分岐点とシナプス末端における活性なゾーンの数の数( 図1) 。終末の数を決定するためのアルゴリズムは、このマクロに存在しているが、精度17の基準を満たしませんでした。適切終末の数を評価するために、具体的には、抗シナプトタグミン(SYT)または抗システインストリングタンパク質(CSP)によって免疫染色NMJ製剤を用いて終末を定量化するために設計された「 ショウジョウバエ NMJブートン形態計測」マクロを使用する必要があり、そしてBRPとの共免疫標識。終末の数、NMJのブートン領域、NMJ長、NMJ最長枝長、島の数、分岐の数、分岐点の数および活性ZOの数:「ショウジョウバエ NMJブートン形態計測」マクロは、以下のパラメータを定量化NE( 図2)。
マクロは、3つのサブマクロから成る:(I)「スタックに変換」は、すべての利用可能な画像ファイルを識別し、Z-hyperstacksと両チャンネルの最大強度投影を作成します。出力として、このマクロは、「stack_image_name」と「flatstack_image_name」と呼ばれるシナプスごとに2つの新しいファイルが生成されます。 II)連続して、すべての最大投影像「flatstack_image_name」を開き、手動で関心のある特定のシナプスの端末が存在する関心領域(ROI)を定義するための要求でそれらを提示する「ROIの定義」。これは、隣接する筋肉及び/又は画像11に存在することができる(例えば1秒など)シナプス末端の他のタイプに接続するシナプスの排除を可能にするために実施されました。 (III)ROIの境界内の画像のすべての領域に完全に自動化された分析を適用し、「分析」。として全ての数値測定が注釈されます「RESULTS.TXT」とマクロによって生成される基礎となる画像セグメンテーションを説明する「res_image_name.tif」:このステップの結果、ユーザは、2つの新しいファイルを取得します。 NMJアウトライン、NMJ骨格、およびBRP-正極活ゾーンの数:画像解析中に3つの構造は、各シナプス末端から誘導されます。 NMJ輪郭はNMJ面積およびその周囲を決定するために使用され、その後の流域の分離は、終末の数を提供します。スケルトンから、5つのNMJの機能が推定される総NMJ長さ、任意の2つのエンドポイントを結ぶ連続最長パスの長さの和(最長分岐長)、NMJ当たりの未接続区画の数(「島」と呼ばれます)、分岐の数、分岐点(一方の分岐点が3つ以上のブランチを接続)の数。アクティブなゾーンの数をカウントすることによってBRPチャネルに決定されますBRP-陽性スポット。 (注釈付きNMJ輪郭(黄線)、NMJ骨格(青線)、及び(白病巣で示す)BRP-正極活ゾーンの数は、結果画面に表示され、パラメータの測定をするために処理されます。 TXT)出力ファイル( 図3)。
ショウジョウバエ NMJ形態計測」および『 ショウジョウバエ NMJブートン形態計測はショウジョウバエ NMJ形態計測『および『 ショウジョウバエ NMJブートン形態計測』』最初に説明し、広範囲Nijhof ら 17によって検証した。この論文は、マクロを使用して、NMJの形態を分析する方法に焦点を当てて』。それにもかかわらず、マクロ支援分析、NMJ解剖および免疫染色の前に実行する必要がある。これらは重要なステップであり、そして免疫組織化学のために使用されるマーカーの組み合わせは、マクロ分析に適していることが必要である。これらの手順は簡単にSEに記載されていますこのプロトコルのction 1及びこれらの手順を実行するために詳細にプロトコルを記述参照にユーザーを導きます。
「 ショウジョウバエ NMJ形態計測」と「 ショウジョウバエ NMJブトン形態計測は、」シナプスの形態を評価することに興味を持って研究者のための強力なツールです。 NMJのパラメータの手動評価は面倒です。それはマクロが15分に経験豊富な研究者を救うであろうと推定されている/ NMJは、手動画像セグメンテーションに費やしました。条件または遺伝子型ごとに評価したシナプスの1〜2ダースで、これはすぐにでも小規模の研究では、保存された時間のかなりの量を合計します。大画面を行う場合、手動評価および定量化に比べ、ハイスループット分析を使用しての利得は、巨大であり得ます。スループットの向上に加えて、マクロが容易に客観的な分析を提供すること。彼らは、そうでない場合は盲目の実験と同様に、複数の研究者が分析に関与しているときに発生する対人の違いを必要とする個人的な偏見を除外します。最後に、マクロは敏感かつ正確なANを提供します劇的なNMJ欠陥よりもむしろ微妙な原因と、これまで研究者の目によって正しく評価されていない残っているシナプス制御因子の同定を可能にするNMJの機能のalysis、。検証手順およびマクロに利用するアルゴリズムについての詳細な情報は、パブリケーションNijhof らに見出されます。 17。
マクロの機能が適切に引き続き筋肉4.でキイロショウジョウバエのNMJの形態学的特徴を測定することが確認されている、それはマクロもこの生物において他の筋肉でシナプスを分析するのに適したことが示されました。マクロは、他のショウジョウバエの種、さらに昆虫を含む他の種で同様の構造を持つNMJの形態学的パラメータを測定するために使用することができる可能性が高いです。進化では非常に遠くでものNMJ、 例えば、マウスののNMJは、非常に似た構造の立体構造29を示し、。マクロは、他の種からのNMJの準備でテストされていないが、潜在的なユーザーは、このような目的のためにマクロをテストすることをお勧めします。
ユーザーが画像に適したマクロ設定を選択/定義するためにさまざまな自動しきい値とアルゴリズムを探ることが非常に重要です。マクロ評価は手動評価と比較した場合、これらの設定で、約95%の精度が達成されます。適切に画像のセグメント100%が非常に面倒又は不可能でさえ処置することができるマクロ設定を調整します。その数は5%以下である場合はそのため、適切にセグメント化されていない画像の排除が推奨されます。画像の品質が低い場合には明らかに、マクロが不十分な画像セグメンテーションのより高い比率を生成します。低品質の画像は、同様に手動評価に影響を与えることになるので、マクロのパフォーマンスにリンクすることはできません。彼らは画像のために設計されたとしてもかかわらずマクロはかなり頑丈です高含量顕微鏡17(多数のサンプルのイメージングを可能にする自動化蛍光顕微鏡)で生成されたS。
重要な点は、ユーザーが視覚的にマクロによって生成されたすべての結果の画像を検査ということです。これは不満足なセグメンテーションと一緒に写真を検出して排除することができます。このプロトコルのセクション6において、ユーザは、「分析」サブマクロを実行するときに正しい画像セグメンテーションのための設定を調整する方法を案内されます。すぐにマクロの要件とどのようにマクロの設定「マクロの設定をExamples_adjusting」というフォルダを調整することで理解するには、マクロリポジトリhttps://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2aに含まれています。サーティーンサブフォルダ、異なる顕微鏡プラットフォーム(高含有量/共焦点/蛍光顕微鏡)と異なる免疫染色で得られた実施例の画像とのそれぞれが、設けられています。 「例のガイド」と題されたPDFを同じに含まれています各実施例に必要な設定が期待結果と結果の画像を提供するテキストドキュメントとともに提供されるフォルダー。
マクロが.TIFFファイルを分けて保存された画像を処理するように設計された、それにもかかわらず、一部のユーザーは、さまざまな形式で自分の画像を保存している場合があります。ドキュメントのマクロに画像をインポートする方法の詳細な手順で「例ガイド」 -以下のウェブサイトhttps://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a 21は、3つのサンプルファイル(3例1)「 ショウジョウバエ NMJ」という名前のフォルダが含まれています.TIFF分離したファイルとして保存されていない場合も、同じフォルダに格納されています。
NMJ面積、NMJ周囲長、終末の数、NMJのブトンエリア、NMJ長、NMJ最長支店長、イスラの数:一緒に、「 ショウジョウバエ NMJ形態計測」と「 ショウジョウバエ NMJブトン形態計測」マクロは10種類のNMJの機能を定量化NDS、分岐の数、分岐点の数とアクティブなゾーンの数。これは、1つまたは少数のシナプス機能30、31を評価することができ、これまでに利用可能なツール上で大きな利点を提供します。マルチパラメトリック定量分析は、シナプスの生物学の多くの側面までの1を制御する新たな規制当局を特定するために、例えば 、新たな発見のための大きな可能性を負いません。それはまた、全く同じ又は重複NMJ機能をcoregulate、したがって共通の分子経路で動作する可能性がある遺伝子を決定するために必要な解像度を提供します。最後に、シナプスのパラメータは、遺伝子は、このような協調形態学的相関を確保邪魔されずに条件17とで相互に関連付ける方法を異なる調査する可能性を開きます。
まとめると、このプロトコルは、「 ショウジョウバエ NMJ形態計測」二つのマクロを使用する方法を説明し、ハイスループット様式で10の形態素NMJ機能の客観的かつ高感度定量を行う「 ショウジョウバエ NMJブートン形態計測」、。
The authors have nothing to disclose.
我々はショウジョウバエ株を提供するためのウィーンショウジョウバエリソースセンターとブルーミントンショウジョウバエストック・センター(NIH P40OD018537)を認めます。私たちは、イメージングの専門家支援のための顕微鏡的イメージングセンターからジャック・フランセン感謝します。この研究は、ドイツの精神遅滞のネットワークにより、2 DCN /ラートボウト大学医療センターの博士フェローシップによって、VIDIおよび科学研究費オランダ機構(NWO)からTOP助成金(917-96-346、912-12-109)によってサポートされていました教育研究(BMBF)のドイツ連邦環境省のNGFN +プログラムによっておよびASへの欧州連合(EU)のFP7の大規模な統合ネットワークGencodys(HEALTH-241995)によって資金を供給。資金提供者は、研究デザイン、データの収集と分析、公表することを決定、または原稿の準備で何の役割を持っていました。
Immunostainings | Dilution | ||
Mouse anti-discs large 1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | AFFN-DLG1-4D6 | 1/25 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit) |
Rabbit anti-horseradish peroxidase | Jackson IR | 323-005-021 | 1/500 |
Rabbit anti-Synaptotagmin | Gift from Hugo Bellen | Jan-00 | |
Mouse anti-Cysteine string protein | Developmental Studies Hybridoma Bank | DCSP-1(ab49) | 1/10 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit) |
Mouse anti-Bruchpilot | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Jan-50 |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Life technologies | A11029 | 1/200 |
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Life technologies | A11011 | 1/500 |
Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling Kit | ThermoFisher | Z25006 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36930 | |
Material | Company | Catalog number | Comments |
Equipment | |||
Confocal microscope or fluorescence microscope | Leica SP5 | ||
Zeiss Axio imager | |||
Computer | Mac or Pc | ||
Material | Company | Catalog number | Comments |
Software | |||
FIJI |