Étiquetage des colorants fluorescents des érythrocytes et des leucocytes pour étudier la dynamique du flux dans la circulation de la rétine de la souris
Summary
L'imagerie à cellules vivantes des cellules sanguines marquées dans la circulation oculaire peut fournir des informations sur l'inflammation et l'ischémie dans la rétinopathie diabétique et la dégénérescence maculaire liée à l'âge. Un protocole pour étiqueter les cellules sanguines et l'image des cellules marquées dans la circulation de la rétine est décrit.
Abstract
La dynamique du flux sanguin rétinien et choroidal peut donner un aperçu de la pathophysiologie et des séquelles de diverses maladies oculaires telles que le glaucome, la rétinopathie diabétique, la dégénérescence maculaire liée à l'âge (AMD) et d'autres affections inflammatoires oculaires. Il peut également aider à surveiller les réponses thérapeutiques dans l'œil. L'étiquetage correct des cellules sanguines, couplé à l'imagerie des cellules vivantes des cellules marquées, permet d'étudier la dynamique de l'écoulement dans la circulation rétinienne et choroïde. Ici, nous décrivons les protocoles normalisés de 1,5% d'indocyanine vert (ICG) et de 1% de fluorescéine de sodium sur l'étiquetage des souris érythrocytes et les leucocytes, respectivement. On a appliqué une ophtalmoscopie laser à balayage (SLO) pour visualiser les cellules marquées dans la circulation rétinienne des souris C57BL / 6J (type sauvage). Les deux méthodes ont démontré des cellules séparées fluorescentes dans la circulation de la rétine de la souris. Ces méthodes d'étiquetage peuvent avoir des applications plus larges dans diverses maladies oculairesdes modèles.
Introduction
L'étude de la dynamique de l'écoulement des cellules sanguines dans la circulation rétinienne et choroïdienne est impératif pour comprendre la pathogenèse des maladies oculaires potentiellement visibles pour la vision et d'autres affections inflammatoires oculaires. Cependant, les techniques d'angiographie conventionnelles, qui impliquent la liaison de colorants fluorescents aux protéines plasmatiques, ne fournissent aucune information concernant la dynamique des érythrocytes ou des leucocytes 1 . La dynamique des flux rétiniens des érythrocytes est importante pour étudier la circulation métaboliquement efficace dans la rétine et la dynamique des flux de leucocytes, pour comprendre la migration cellulaire, la reconnaissance, l'adhésion et la destruction dans diverses conditions inflammatoires 2 . Il existe plusieurs molécules fluorescentes utilisées dans l'identification et la caractérisation de différents types de cellules 3 . L'hémodynamique des cellules sanguines peut être mesurée en les colorant avec les fluorescences appropriéesCent et appliquant les techniques d'imagerie appropriées 4 .
La présence de réponses inflammatoires dans les maladies intraoculaires comme la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) et la rétinopathie diabétique (DR) impliquent l'accumulation de lymphocytes dans la zone malade 5 , 6 . Le suivi des cellules immunitaires dans les tissus peut aider à comprendre les événements complexes impliqués dans le mécanisme de la pathogenèse de la maladie. Les isotopes radioactifs comme 51 Cr et 125 I ont été utilisés comme traceurs cellulaires lors d'études précoces. Ces colorants sont toxiques et affectent la viabilité cellulaire. Bien que les marqueurs radioactifs 3 H et 14 C soient moins toxiques pour les cellules, en raison de leurs énergies d'émission plus faibles, il est difficile de détecter leurs signaux dans le système 7 , 8 . Un certain nombre de colorants fluorochrome ont été introduits pour surmonter les problèmes potentiels associés wIth marqueurs radioactifs et suivi de la migration des lymphocytes à l' aide de microscopie fluorescente et de cytométrie en flux 9 , 10 . Hoechst 33342 et l'orange thiazole sont des colorants fluorescents liés à l'ADN, qui sont utilisés pour suivre les lymphocytes in vivo. Hoechst 33342 se lie aux régions riches en AT dans l'ADN, est perméable à la membrane, conserve les signaux fluorescents pendant 2 à 4 jours et résiste à la trempe 9 , 10 . Les inconvénients de Hoechst 33342 et de l'orange thiazole sont l'inhibition de la prolifération lymphocytaire 11 et la demi-vie courte, respectivement 9 .
Calcein-AM, diacétate de fluorescéine (FDA), 2 ', 7'-bis- (2-carboxyéthyl) -5- (et -6) -carboxyfluorescéine, acétoxyméthyl ester (BCECF-AM), 5- (et -6) Le diacétate de carboxyfluorescéine (CFDA) et l'ester acétoxyméthylique de diacétate de 5 (et -6) -carboxyfluorescéine (CFDA-AM)Sont les colorants fluorescents cytoplasmiques utilisés pour les études sur les migrations de lymphocytes. Cependant, la FDA, la CFDA et la CFDA-AM ont une rétention plus faible dans les cellules 9 . BCECF-AM réduit la réponse proliférative et influence la chimiotaxis et la production de superoxyde 9 , 12 . Calcein-AM est un colorant fluorescent et utile pour des études de migration de lymphocytes à vivo court terme. Il émet de solides signaux fluorescents, n'interfère pas avec la plupart des fonctions cellulaires et conserve des signaux fluorescents jusqu'à 3 jours 12 , 13 . L'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) et l'ester succinimidylique de diacétate de carboxyfluorescéine (CFDA-SE) sont des colorants fluorescents à couplage covalent, qui sont utilisés pour des études de migration de lymphocytes. FITC ne présente aucun effet sur la viabilité cellulaire et a une affinité plus forte avec les lymphocytes B que les lymphocytes T 14 , 15 </suP>. Les lymphocytes marqués au CFDA-SE peuvent être suivis in vivo pendant plus de 8 semaines et jusqu'à 8 divisions cellulaires 9 , 16 . C18 DiI (1,1'-dioctadécyl-3,3,3 ', 3'-tétraméthylindocarbocyanine perchlorate), DiO (3,3'-dioctadécyloxacarbocyanine perchlorate), Paul Karl Horan (PKH) 2, PKH3 et PKH26 sont membranaires- L'insertion de colorants fluorescents de carbocyanine lipophiles utilisés pour étiqueter les leucocytes et les érythrocytes. C18 Dil et DiO présentent des signaux plus élevés lorsqu'ils sont incorporés dans la membrane cellulaire et sont relativement non toxiques 12 , 17 . Les cellules marquées PKH2, PKH3 et PKH26 présentent une bonne conservation des signaux fluorescents avec moins de toxicité 18 , 19 , 20 , 21 , 22 . Cependant, PKH2 down régule l'expression CD62L et réduit considérablement Viabilité des radiopathies 23 .
La plupart des études mentionnées ci-dessus ont été réalisées pour suivre la migration et la prolifération des lymphocytes dans les lymphatiques et étudier les érythrocytes marqués dans la circulation non-oculaire. Il existe très peu d'études appliquant les techniques d'étiquetage pour étudier les cellules sanguines dans la circulation oculaire. L'application de l'ophtalmoscopie laser à balayage (SLO) a un grand avantage dans l'étude des cellules marquées dans la circulation rétinienne et choroïde in vivo par angio-graphie du fondus 24 . Il existe plusieurs colorants fluorescents, tels que l'ICG, l'orange d'acridine, la FITC, la fluorescéine de sodium et les CFDA qui sont utilisés pour étudier les leucocytes dans la circulation de la rétine par SLO 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 ,Class = "xref"> 31 , 32 , 33 , 34 . La phototoxicité et la cancérogénicité de l'orange de l'acridine 26 , 27 , l'interférence de la FITC avec l'activité cellulaire et l'exigence d'un agent de contraste intravasculaire pour la résolution des vaisseaux sanguins rétiniens et choroïdiens limitent leur application dans des expériences animales in vivo 29 . La fluorescéine au sodium et la GIC sont non toxiques, approuvées par la Food and Drug Administration, et sont sûres pour les tests sur les humains 32 , 35 . La plupart des études dynamiques de flux sont liées à l'étiquetage des leucocytes ou des érythrocytes et à leur visualisation dans les vaisseaux sanguins rétiniens et choroïdaux 36 , 37 , 38 , 39 </sHaut>. Ici, nous décrivons un protocole normalisé d'étiquetage ICG des érythrocytes, le marquage par fluorescéine de sodium des leucocytes et le suivi des cellules étiquetées visualisées dans la circulation de la rétine de la souris à l'aide de SLO.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'étude de l'hémodynamique dans la circulation rétinienne et choroïdienne est essentielle pour comprendre la pathophysiologie de nombreuses maladies oculaires. La dynamique du flux sanguin dans la circulation de la rétine peut être étudiée par tomographie par cohérence optique à Fourier (FD-OCT), par laser speckle flowgraphy (LSFG) et par oxymétrie rétinienne. Bien que ces méthodes utilisent différentes approches pour étudier le flux sanguin total dans la circulation de la rétine <sup class="xref…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le projet de recherche a été financé dans le cadre de la subvention du nouveau chercheur du National Medical Research Council (NMRC), à Singapour. L'équipe souhaitera reconnaître la formation de recherche fournie au docteur Agrawal à l'Institut d'ophtalmologie (IOO), au collège universitaire de Londres (UCL) au titre de la bourse de formation en recherche outre-mer du Conseil national de recherches médicales (NMRC) de novembre 2012 à octobre 2014 sous mentorat du Prof. David Shima. Le Dr Agrawal a acquis le concept et les compétences pour l'étiquetage des cellules et l'imagerie en direct dans le laboratoire du Dr Shima. L'équipe souhaitera donc reconnaître la supervision et l'orientation lors de la bourse de formation du Prof. David Shima, Pro.f Kenith Meissner, Dr. Peter Lundh et Dr. Daiju Iwata.
Materials
| Cardiogreen polymethine dye (Indocyanine green) | Sigma Aldrich | 12633-50MG | |
| Fluorescein 100 mg/mL | Novartis | U1705A/H-1330292 | |
| 10X Phosphate-buffered saline (PBS) Ultra Pure Grade | 1st BASE | BUF-2040-10X1L | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Microtainer tubes with K2E (K2EDTA) – EDTA concentration – 1.8 mg/mL of blood | BD, USA | REF 365974 | |
| Histopaque 1077 solution | Sigma Aldrich | 10771 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 05-413-401 | |
| Microcentrifuge tubes 2mL | Axygen | MCT-200-C-S | |
| Vortex mixer | Insta BioAnalytik pte. ltd | FINE VORTEX | |
| Shaker incubator | Lab Tech | ||
| Ceva Ketamine injection (Ketamine hydrochloride 100mg/mL) | Ceva | KETALAB03 | |
| ILIUM XYLAZIL-20 (Xylazine hydrochloride 20mg/Ml) | Troy Laboratories PTY. Limited | LI0605 | |
| 1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamide 1%) | Alcon Laboratories, Inc. USA | NDC 0998-0355-15 | |
| 2.5% Mydfrin 5 mL (Phenylephrine hydrochloride 2.5%) | Alcon Laboratories, Inc. USA | NDC 0998-0342-05 | |
| Terumo syringe with needle 1cc/mL Tuberculin | Terumo (Philippenes) Corporation, Philippines | SS-01T2613 | |
| Vidisic Gel 10G | Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Germany | ||
| Alcohol swabs | Assure medical disposables | 7M-004-L-01 | |
| Confocal laser scanning angiography system (Heidelberg Retina Angiograph 2) | Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| Hiedelberg Spectralis Viewing Module software, v4.0 | Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| Fluorescent microscope | ZEISS | Model: axio imager z1 |
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