Uma abordagem baseada em Espectrometria Tandem Cromatografia Líquida de Massachusetts para análise de metabolitos de<em> Staphylococcus aureus</em

Summary

Aqui, descrevemos um protocolo para a extracção de metabolitos a partir de Staphylococcus aureus e a sua subsequente análise por meio de cromatografia líquida e espectrometria de massa.

Abstract

Em um esforço para frustrar patógenos bacterianos, os anfitriões muitas vezes limitam a disponibilidade de nutrientes no local da infecção. Esta limitação pode alterar as abundâncias de metabólitos chave para os quais fatores regulatórios respondem, ajustando o metabolismo celular. Nos últimos anos, um número de proteínas e de ARN surgiram como importantes reguladores da expressão de genes de virulência. Por exemplo, a proteína Cody responde a níveis de aminoácidos de cadeia ramificada e de GTP e é amplamente conservada em baixo G + C bactérias Gram-positivas. Como um regulador global em Staphylococcus aureus, Cody controla a expressão de dúzias de genes de virulência e metabólicas. Nossa hipótese é que S. aureus usa Cody, em parte, para alterar seu estado metabólico em um esforço para se adaptar às condições de limitação de nutrientes potencialmente encontrados no ambiente de host. Este manuscrito descreve um método para a extracção e análise de metabolitos a partir de S. aureus utilizando cromatografia líquida acoplada com espectrometria de massatrometry, um protocolo que foi desenvolvido para testar esta hipótese. O método também destaca as melhores práticas que irão garantir rigor e reprodutibilidade, tais como manter o estado estacionário biológico e aeração constante sem o uso de culturas quimiostato contínuas. Em relação aos USA200 sensível à meticilina S. aureus isolar UAMS-1 estirpe parental, o mutante isogico Cody exibiram aumentos significativos na aminoácidos derivados a partir de aspartato (por exemplo, treonina e isoleucina) e diminui em seus precursores (por exemplo, aspartato e O -acetylhomoserine ). Estes resultados correlacionam-se bem com os dados obtidos com análise de transcrição de ARN-seguintes: os genes nestas vias foram supra-regulados entre 10 e 800 vezes no mutante nulo Cody. Acoplamento análises globais do transcriptoma e metaboloma pode revelar como as bactérias alterar o seu metabolismo, quando confrontado com o estresse ambiental ou nutricional, proporcionando potencial visão sobre as physmudanças iological associados com esgotamento de nutrientes experimentado durante a infecção. Tais descobertas podem abrir o caminho para o desenvolvimento de novos anti-infecciosos e terapêutica.

Introduction

patógenos bacterianos devem lidar com muitos desafios dentro do ambiente de host. Além de ataque directo por células do sistema imunológico, o hospedeiro também sequestra nutrientes essenciais para a sobrevivência das bactérias e a replicação, gerando imunidade nutricional ^{1, 2.} Para sobreviver nestes ambientes hostis, patógenos bacterianos implantar fatores de virulência. Alguns destes factores de permitir que as bactérias para evadir a resposta imune; Outros factores incluem segregada enzimas digestivas, tais como hialuronidase, termonuclease, e lipases, que podem permitir que as bactérias para reabastecer nutrientes em falta por consumir constituintes derivadas de tecido ^{3, 4, 5.} Com efeito, as bactérias têm evoluído sistemas reguladores que ligam o estado fisiológico da célula para a produção de factores de virulência ^{6, 7,} <s -se class = "xref"> ^{8, 9, 10.}

Um crescente corpo de evidências aponta para Cody como um regulador crítico que liga o metabolismo e virulência. Embora descoberto pela primeira vez em Bacillus subtilis como um repressor do gene dipéptido permease (dpp) ^11, Cody é agora conhecido por ser produzido por quase todas as bactérias em G + C Gram-positivos baixos ^{12, 13} e regula dezenas de genes envolvidos em carbono e metabolismo ^{14, 15, 16, 17, 18, 19} de azoto. Em espécies patogénicas, Cody também controla a expressão de alguns dos mais importantes genes de virulência ^{de 20, 21,}. ef "> ^{22, 23, 24, 25, 26, 27} Cody é activada como uma proteína de ligação de ADN por duas classes de ligandos: aminoácidos de cadeia ramificada (BCAA, isoleucina, leucina, e valina [ILV]) e GTP . Quando estes nutrientes são abundante, Cody reprime (ou em alguns casos, estimula) a transcrição. Como estes nutrientes tornam-se limitadas, actividade Cody é progressivamente reduzido, o que resulta em uma resposta transcripcional graduada que re-rotas precursores por meio de várias vias metabólicas ligados ao metabolismo central ^{28, 29, 30.}
Em tandem cromatografia luida acoplada a espectrometria de massa (LC-MS) é uma técnica poderosa que pode identificar e quantificar com precisão pequenas moléculas metabolitos intracelulares ^31. Quando emparelhado com transcanálise riptome (por exemplo, ARN-SEQ), este fluxo de trabalho analítico pode fornecer informações sobre as alterações fisiológicas que ocorrem em resposta ao stress ambiental ou nutricional. Aqui, apresentam-se um método para a extracção de metabolitos a partir de células de Staphylococcus aureus e subsequente análise por meio de LC-MS. Esta abordagem tem sido usada para demonstrar os efeitos pleiotrópicos das Cody sobre S. aureus fisiologia.

Protocol

1. Preparação de Soluções Tampão Preparar solução salina tamponada com fosfato (PBS; pH 7,4) por diluição de uma solução de reserva de 10x PBS para uma concentração final de 1x com água ultrapura (desionizada destilada e). Preparar a solução de têmpera através da combinação de 2 mL de acetonitrilo, 2 mL de metanol, 1 mL de H2O ultra-pura, e 19 uL (concentração final 0,1 mM) de ácido fórmico. Prepare LC-MS solvente A pela adição de ácido fórmico (0,2% …

Representative Results

Analisamos piscinas metabolitos intracelulares em S. aureus durante crescimento in vitro num meio rico, complexo. Como prova de princípio, foram comparados os perfis de metabolitos entre o S. aureus sensível à meticilina osteomielite isolar UAMS-1 (tipo selvagem [WT]) e uma estirpe isogénica sem o regulador transcricional mundial Cody (Δ Cody) 26. O estado estacionário, culturas exponenciais das estirpes WT e Cody…

Discussion

Todos os metabolitos de pequenas moléculas são ligadas uma à outra através das suas origens comuns em vias metabólicas centrais. Durante o crescimento exponencial, as células bacterianas são em estado estacionário biológica e metabólica, fornecendo um instantâneo do estado fisiológico sob condições específicas. Cody monitora suficiência de nutrientes por responder a ILV e GTP. Como ILV e GTP piscinas gota, actividade Cody é provável progressivamente reduzido, ajustando a expressão dos seus genes-alvo …

Materials

Material/Equipmenta
DeLong Culture Flask (250 ml)	Belco	2510-00250
Sidearm Flask, 500 ml	Pyrex	5340
3-hole Rubber Stopper, #7	Fisher	14-131E
Stainless Steel Filter holder/frit	VWR	89428-936
Petri Dish, 35 mm	Corning	430588	Not tissue culture treated
Mixed cellulose ester membrane, 0.22 μm pore size	Millipore	GSWP02500
Impact-resistant tubes, 2 ml	USA Scientific	1420-9600
Silica Beads, 0.1 mm	Biospec Products Inc	11079101Z
Precellys 24 homogenizer	Bertin Instruments	EQ03119-200-RD000.0
Micro BCA Protein Assay Kit	Pierce (Thermo Scientific)	23235
Cogent Diamond hydride type C column	Agilent	70000-15P-2
Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 Series	Agilent	G6230B
Quat Pump, 1290 Series	Agilent	G4204A
Bin Pump, 1290 Series	Agilent	G4220A
Valve Drive, 1290 Series	Agilent	G1107A
Isocratic Pump, 1290 Series	Agilent	G1310B
TCC, 1290 Series	Agilent	G1316C
Sampler, 1290 Series	Agilent	G4226A
Thermostat, 1290 Series	Agilent	G1330B
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemical
Tryptic Soy Broth	Becton Dickinson	211825
Difco Agar, Granulated	Becton Dickinson	214530	Solid media contains 1.5% [w/v] agar
Phosphate-buffered saline (pH 7.4) 10X	Ambion	AM9624	Dilute fresh to 1X with ultra-pure water
Acetonitrile	Fisher Scientific	A955-500	Optima LC-MS
Methanol	Fisher Scientific	A456-500	Optima LC-MS; toxic
Formic Acid	Sigma Aldrich	94318	For mass spectrometry, 98%
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
MassHunter	Agilent	G3337AA
Bacterial Strain	Species	Strain	Genotype
SRB 337	Staphylococcus aureus	USA200 MSSA UAMS-1	wild type
SRB 372	Staphylococcus aureus	USA200 MSSA UAMS-1	ΔcodY::erm
aChemicals and materials listed are specific to the method described and do not include standard laboratory chemicals or supplies.