Ganzzellige Aufnahmen von Drosophila Melanogaster Photorezeptoren ermöglichen die Messung von spontanen Dunkelstößen, Quantenstößen, makroskopischen Reaktionen auf Licht und Strom-Spannungs-Beziehungen unter verschiedenen Bedingungen. In Kombination mit D. melanogaster genetischen Manipulationswerkzeugen ermöglicht diese Methode die Untersuchung des ubiquitären Inositol-Lipid-Signalwegs und seines Ziels, des TRP-Kanals.
Ganzzellige Spannungsklemmenaufnahmen von Drosophila melanogaster Photorezeptoren haben das Feld der wirbellosen visuellen Transduktion revolutioniert, was die Verwendung von D. melanogaster Molekulargenetik ermöglicht, um Inositol-Lipid-Signalisierung und Transient Receptor Potential (TRP) -Kanäle auf Einzelmolekül-Ebene zu untersuchen. Eine Handvoll Labore haben diese mächtige Technik beherrscht, die es ermöglicht, die physiologischen Reaktionen unter stark kontrollierten Bedingungen zu beleuchten. Diese Technik ermöglicht die Kontrolle über die intrazellulären und extrazellulären Medien; Die Membranspannung; Und die schnelle Anwendung von pharmakologischen Verbindungen, wie einer Vielzahl von Ionen- oder pH-Indikatoren, auf die intra- und extrazellulären Medien. Mit einem außergewöhnlich hohen Signal-Rausch-Verhältnis ermöglicht dieses Verfahren die Messung von dunklen spontanen und lichtinduzierten Einheitsströmen ( zB Spontan- und Quantenstößen) und makroskopischen Lichtinduzierten Strömen (LIC) aus der SündeGle D. melanogaster photorezeptoren Dieses Protokoll skizziert im Detail alle wichtigen Schritte, die notwendig sind, um diese Technik durchzuführen, die sowohl elektrophysiologische als auch optische Aufnahmen beinhaltet. Das Fliegen-Retina-Dissektionsverfahren für die Erreichung von intakten und lebensfähigen ex vivo- isolierten Omatidien in der Badkammer wird beschrieben. Die Ausrüstung, die für die Durchführung von Ganzzell- und Fluoreszenz-Bildgebungsmessungen erforderlich ist, ist ebenfalls detailliert. Schließlich werden die Fallstricke bei der Verwendung dieser zarten Vorbereitung bei längeren Experimenten erklärt.
Umfangreiche genetische Untersuchungen der Fruchtfliege , Drosophila melanogaster ( D. melanogaster) , die vor mehr als 100 Jahren initiiert wurde, haben die D. melanogaster- Fliege als äußerst nützliches experimentelles Modell für die genetische Dissektion komplexer biologischer Prozesse etabliert. Die unten beschriebene Methodik kombiniert die akkumulierte Kraft von D. melanogaster Molekulargenetik mit dem hohen Signal-Rausch-Verhältnis von Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen. Diese Kombination ermöglicht die Untersuchung von D. melanogaster Phototransduktion als Modell der Inositol-Lipid-Signalisierung und TRP-Kanalregulation und -aktivierung sowohl in der nativen Umgebung als auch in der höchsten Auflösung einzelner Moleküle.
Die Anwendung der Ganzzell-Aufzeichnungsmethode auf D. melanogaster Photorezeptoren hat das Studium der Wirbellosen-Phototransduktion revolutioniert. Diese Methode wurde von Hardie 1 und indep entwickeltEndlich von Ranganathan und Kollegen vor 2 ~ 26 Jahren und wurde entworfen, um die umfangreichen genetischen Manipulationswerkzeuge von D. melanogaster auszunutzen und sie zu verwenden, um Mechanismen der Phototransduktion und Inositol-Lipid-Signalisierung aufzudecken. Zunächst litt diese Technik unter einer raschen Verringerung der Lichtempfindlichkeit und einer geringen Ausbeute an Ommatidien während des Sektionsprozesses, die detaillierte quantitative Studien verhinderten. Später erhöhte die Zugabe von ATP und NAD zur Patchpipette die Eignung der Präparation für längere quantitative Aufnahmen drastisch. Danach wurde eine umfangreiche Charakterisierung des Signaltransduktionsmechanismus auf molekularer Ebene realisiert.
Derzeit ist die D. melanogaster- Phototransduktion eines der wenigen Systeme, in denen Phosphoinositid-Signalisierungs- und TRP-Kanäle ex-vivo bei Einzelmolekül-Auflösung untersucht werden können. Das macht D. melanogaster fototransduktion und das ichThodologie entwickelt, um diesen Mechanismus ein hochempfindliches Modellsystem zu studieren. Dieses Protokoll beschreibt, wie man die D. melanogaster retina seziert und die isolierten Ommatidien mechanisch von den umgebenden Pigment (Glia) Zellen abstreift. Dies ermöglicht die Bildung einer Giga-Dichtung und einer Ganzzell-Patch-Clamp auf den Photorezeptor-Zellkörpern. Glücklicherweise sind die meisten Signalisierungsproteine auf das Rhabdomere beschränkt und diffundieren nicht. Darüber hinaus gibt es einen immobilen Ca 2+ -Puffer namens Calphotin, der sich zwischen dem Signalisierungskompartiment und dem Zellkörper 3 , 4 befindet , und einem hohen Expressionsniveau des Na + / Ca 2+ -Tauscher (CalX) im Mikrovilli 5 . Gemeinsam erlauben die Protein-Confinement zum Rhabdomere, der Calphotin-Puffer und die hohe Expression des CalX relativ lange ( dh bis zu ~ 20 min) Ganzzell-Aufnahmen ohne den Verlust wesentlicher KomponentenDes Phototransduktionsverfahrens und unter Beibehaltung einer hohen Lichtempfindlichkeit. Das folgende Protokoll beschreibt, wie man isolierte Omatidien erhält und ganze Zellaufnahmen durchführt, die die nativen Eigenschaften der Phototransduktionskaskade bewahren. Vollständige Patch-Clamp-Experimente auf dissoziierten Kakerlaken ( Periplaneta americana ) 6 und Cricket ( Gryllus bimaculatus ) 7 Ommatidien wurden ähnlich wie bei D. melanogaster durchgeführt . Darüber hinaus wurden Patch-Clamp-Experimente an dissoziierten Photorezeptoren der File-Clam, ( Lima scabra ) und Jakobsmuschel ( Pecten-Irradianer ) in einer etwas anderen Weise als die von D. melanogaster durchgeführt , wobei sowohl die Ganzzell- 8- als auch die Einkanal-Messungen durchgeführt wurden 9 Hier werden die wichtigsten Errungenschaften, die in D. melanogaster mit dieser Technik erhalten wurden, beschrieben. Die Diskussion iSchließt die Beschreibung einiger Fallstricke und Einschränkungen dieser Technik ein.
Die Anwendung von Ganzzell-Aufnahmen auf D. melanogaster Photorezeptoren erlaubte die Entdeckung und die funktionelle Aufklärung von neuartigen Signalproteinen wie TRP-Kanälen 27 , 28 , 29 und INAD 30 , 31 , 32 Gerüstprotein. Seit der ersten Einführung dieser Technik ermöglichte es die Auflösung von langfristigen Grundfragen bezüglich des Ionenmechanismus und der Spannungsabhängigkeit der Lichtreaktion. Dies geschah aufgrund der verliehenen Fähigkeit, die Membranspannung und die extrazelluläre und intrazelluläre ionische Zusammensetzung 19 , 28 genau zu steuern.
Ein großes Hindernis der Patch-Clamping-Technik in D. melanogaster war die Zerbrechlichkeit der isolierten ommatidia prepaRation. Detaillierte Untersuchungen haben ergeben, dass die Integrität der Phototransduktionsmaschinen kritisch von der kontinuierlichen Versorgung von ATP abhängt, insbesondere bei der Belichtung, was zu einem großen Verbrauch an ATP führt. Leider beseitigt die mechanische Streifenung der Pigment- ( dh Glia) -Zellen, die mit der Patchpipette zur Photorezeptormembran gelangen muss, die Hauptquelle der für die ATP-Produktion notwendigen Metaboliten 33 . Die Anwendung von exogenem ATP in die Aufzeichnungspipette erfüllt nur teilweise die Forderung nach großen Mengen an ATP. Eine kurze Versorgung mit ATP führt zu einer spontanen Aktivierung der TRP-Kanäle und zur Dissoziation der Phototransduktionsmaschinerie aus den lichtaktivierten Kanälen, was zu einer starken Zunahme des zellulären Ca 2+ und der Abschaffung der normalen Reaktion auf das Licht 34 , 35 führt . Diese Folge von Ereignissen ist nicht auf Schäden an derPhotorezeptoren durch das Sektionsverfahren, sondern vielmehr die zelluläre Erschöpfung von ATP. Um zu verhindern, dass diese Folge von Ereignissen auftritt und normale Lichtreaktionen aufrechterhalten wird, sollten die Photorezeptoren nicht intensiven Lichtern ausgesetzt werden, die große Mengen an ATP verbrauchen. Auch muss NAD in die Aufzeichnungspipette aufgenommen werden, vermutlich um die ATP-Produktion in den Mitochondrien 18 , 36 zu erleichtern. Für Messungen von Spontan- und Quantenstößen ist die obige Schwierigkeit minimal, da nur schwache Lichter verwendet werden. In der Praxis kann eine stabile Ganzzell-Aufzeichnung für ~ 20-25 min aufrechterhalten werden, obwohl es eine Tendenz gibt, dass die Reaktionskinetik über diesen Zeitraum verlangsamt wird. Eine einmalige Vorbereitung der dissoziierten Ommatidien kann bis zu 2 h lebensfähig bleiben.
Ein zusätzliches Manko der isolierten Ommatidienpräparation ist die Unzugänglichkeit der Mikrovilli, was auf die Unzugänglichkeit der TRP undTRPL-Kanäle zur Aufzeichnungspipette, die Einkanal-Aufnahmen verhindern. Mit einer von ihnen entwickelten Methode gelang es Bacigalupo und Kollegen, die Einkanal-Aktivität aus dem Rhabdomere direkt zu erfassen 37 . Jedoch unterscheidet sich diese Kanalaktivität von der von TRPL-Kanälen, die heterolog in den Gewebekulturzellen 38 exprimiert wurden, und von der TRP-Kanalaktivität, die aus der aus der isolierten Omatidia 34 erhaltenen Schussgeräuschanalyse abgeleitet ist. Vermutlich hat das Dissektionsverfahren die Photorezeptorzellen bei der Verwendung dieses Verfahrens stark beschädigt.
The authors have nothing to disclose.
Der experimentelle Teil dieser Forschung wurde durch Stipendien der US-Israel Bi National Science Foundation (BM und IL), der Israel Science Foundation (ISF), der Deutsch-Israelischen Projektkooperation (DIP) (bis BM) und der Biotechnologie unterstützt Und Biological Sciences Research Council (BBSRC Grant Zahlen: BB / M007006 / 1 und BB / D007585 / 1) zu RCH
10 ml syringe | |||
5 ml syringe | |||
1 ml syringe with elongated tip | |||
Petri dish | 60 mm | ||
Silicone dissection dish/block | Dow Corning | Sylguard 184 Silicone Elastomer Kit | Throughly mix both components, pour into mould and cure for 2 hours at 60ᵒC |
Syringe filters | Millex | 22 µm PVDF filter | |
Capillaries (for omatidia separation) | Glass, 1.2 x 0.68 mm (~7.5 cm each) | ||
Polyethylene Tubing | Becton Dickinson | 1.57 x 1.14 mm (35 cm) | |
2 small beakers | 50 ml or less | ||
2 paraffin film sheets | Parafilm M | ~5 x 5 cm | |
Bath chamber | home made | ||
Cover slips | 22 x 22 mm No. 0 | ||
Paraplast Plus | Sigma | Paraffin – polyisobutylene mixture | To glue the coverslip onto the bottom of the bath chamber |
Ground | Warner Instruments | 64-1288 | Hybrid Assembly Ag-AgCl Wire Assembly |
Headless micro dissection needle | Entomology, 12 mm | ||
Micro dissecting needle holder | |||
Vise | |||
2 fine tweezers + 1 rough tweezers | Dumont #5, Biology | 0.05 x 0.02 mm, length 110 mm, Inox | |
Stereoscopic zoom Microscope | Nikon | SMZ-2B | |
Cold light source | Schott | KL1500 LCD | |
Filter (Color) for cold light source | Schott | RG620 | |
Delicate wipers | Kimtech | Kimwipes | |
Electrode holder | Warner Instruments | QSW-T10P | Q series Holders compatible with Axon amplifiers, straight body style |
Silver Wire | Warner Instruments | 0.25 mm diameter, needs to be chloridized | |
Micromanipulator | Sutter Instruments | MP 85 | Huxley-Wall Style Micromanipulator |
Faraday cage | home made | Electromagnetic noise shielding and black front curtain | |
Anti-vibration Table | Newport | VW-3036-OPT-01 | |
Osilloscope | GW | GOS-622G | |
Perfusion system | Warner Instruments | VC-8P | Pinch valve control system |
Perfusion valve controller | Scientific instruments | BPS-8 | |
Suction system | |||
Amplifier | Molecular Device | Axopatch-1D | |
Head-stage | Molecular Device | CV – 4 | Gain: x 1/100 |
A/D converter | Molecular Device | Digidata 1440A | |
Clampex | Molecular Device | 10 | software |
pCLAMP | Molecular Device | 10 | software |
Light source (Xenon Arc lamp) | Sutter Instruments | Lambda LS | |
Light detector | home made | phototransistor | |
Filter wheel and shutter controller | Sutter Instruments | Lambda 10-2 with a Uniblitz shutter | |
Filters (Natural density filter) | Chroma | 6,5,4,3,2,1,0.5,0.3 | |
Filter (Color) | Schott | OG590, Edge filter | |
Xenon Flash Lamp system | Dr. Rapp OptoElecftronic | JML-C2 | |
Light guide | Quartz | ||
Pulse generator | AMPI | Master 8 | |
Microscope | Olympus | IX71, Inverted | |
Red illumination filter (Microscope) | RG630 / RG645 ø45mm | ||
Microscope objective | Olympus | X60/0.9 UplanFL N air or X60/1.25 UplanFI oil | |
CCD Camera | Andor | iXon DU885K | |
NIS Element | Nikon | AR | software |
Ca+2 indicator | Invitrogen | Calcium green 5N | |
Excitation & emission filters and dichroic mirror | Chroma | 19002 – AT – GFP/FITC Longpass set | |
Vertical pipette puller | Narishige | Model PP83 | Use either vertical or horizontal puller, as preferred. |
Horizontal pipette puller | Sutter Instrument | Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
Filament | Sutter Instrument | 3 mm trough or square box | |
Capillaries | Harvard Apparatus | borosilicate glass capillaries | 1 x 0.58 mm |