Ensaio de Competição Oligopeptídica para Determinação de Sítio de Fosforilação
Summary
Os ensaios de competição de péptidos são amplamente utilizados numa variedade de experiências moleculares e imunológicas. Este artigo descreve um método detalhado para um ensaio de quinase competitiva com oligopéptido in vitro e os procedimentos de validação associados, que podem ser úteis para encontrar locais de fosforilação específicos.
Abstract
A fosforilação de proteínas em locais específicos determina sua conformação e interação com outras moléculas. Assim, a fosforila�o proteica afecta as fun�es biol�icas e as caracter�ticas da c�ula. Atualmente, o método mais comum para descobrir sítios de fosforilação é a análise por cromatografia líquida / espectrometria de massa (LC / MS), um método rápido e sensível. Contudo, as porções de fosfato relativamente lábeis são frequentemente libertadas dos fosfopéptidos durante o passo de fragmentação, o que muitas vezes produz sinais falso-negativos. Nesses casos, um ensaio de quinase in vitro tradicional utilizando mutantes dirigidos ao local seria mais preciso, mas este método é laborioso e demorado. Por conseguinte, pode ser vantajoso um método alternativo utilizando a competição de péptidos. O motivo de reconhecimento de consenso da quinase de proteína activada por monofosfato de adenosina 5 '(AMPK) foi estabelecido 1 e foi validado utilizando um colo de biblioteca de peptídeo de localização de varrimentoAy 2 . Assim, os locais de fosforila�o de AMPK para um novo substrato poderiam ser previstos e confirmados pelos ensaios de competi�o de p�tidos. Neste relatório, descrevemos os passos e procedimentos detalhados para o ensaio de quinase competitiva de oligopéptido in vitro ilustrando a fosforilação do fator 2 do factor nuclear 2 mediado por AMPK (Nrf2). Para autenticar o local de fosforila�o, realizou-se um ensaio sequencial in vitro de quinase utilizando um mutante espec�ico do local. Em geral, o ensaio de competição de péptidos proporciona um método para pesquisar múltiplos locais de fosforilação potenciais e para identificar locais para validação pelos mutantes de sítio de fosforilação.
Introduction
A fosforilação de proteínas num resíduo específico desempenha um papel significativo numa vasta gama de processos celulares. Assim, a compreensão das redes de sinalização requer a identificação de locais específicos de fosforilação. Além disso, o local de fosforilação determina o efeito na função da proteína porque os domínios individuais dentro de uma proteína possuem estruturas e funções diferentes. A atividade do fator nuclear 2 relacionado ao eritróide 2 (Nrf2), um importante fator de transcrição antioxidante, é regulada bidirecionalmente através da fosforilação em diferentes locais. Nossos estudos têm se concentrado nas quinases que catalisam a fosforilação de Nrf2. A resposta ao estresse de Nrf2 contra o desafio oxidativo ocorre rapidamente, principalmente através da fosforilação na serina 40 e mediada pela proteína quinase C (PKC) -δ, que ativa Nrf2 3 , 4 . Por outro lado, Fyn catalisa a fosforilação inibitória de Nrf2 na tirosina 568 para controlo rigoroso da actividade 5 .
O método mais comum utilizado para descobrir locais de fosforilação é a cromatografia líquida / espectrometria de massa (LC / MS). Dados de mapeamento de sítios de fosforilação rápidos e altamente sensíveis podem ser gerados deste modo; No entanto, tem várias limitações técnicas, muitas vezes gerando sinais falsos negativos. Frequentemente ocorre uma fraca cobertura de sequências na análise de LC / MS. Para identificar locais de fosforila�o, �necess�ia informa�o sobre a cobertura m�ima de amino�idos de uma prote�a 6 . A proteólise da proteína de interesse com várias proteases durante o passo de digestão pode ser de ajuda na melhoria da cobertura da sequência. Outro obstáculo para a identificação de resíduos de fosforilação é a fácil perda de ácido fosfórico que é frequentemente observada para os péptidos fosforilados com serina e treonina 6,7. As porções fosfato labílicas são frequentementeLibertado dos fosfopéptidos durante o processo de fragmentação 7 . A segunda opção quando se procura locais de fosforila�o �utilizar um m�odo de microarrays de p�tidos. É possível pesquisar os locais alvo de cinase utilizando um chip de microarray contendo fragmentos peptídicos derivados de uma proteína de interesse. No entanto, devido ao requisito de equipamento para a produção e detecção de um chip de microarray, o método de microarray de péptido é considerado demorado e dispendioso.
Para ultrapassar estes desafios, pode ser utilizado um ensaio de quinase concorrente de oligopéptido in vitro para uma proteína quinase com motivos de reconhecimento conhecidos. Se o motivo de reconhecimento de consenso de uma quinase for estabelecido, os sítios de fosforilação putativos de um substrato candidato podem ser previstos e a autenticidade dos sítios pode ser validada. O método mais convincente para este procedimento é mostrar a anulação da fosforilação numa proteína mutante na qual o predicteD é substituído por um aminoácido não fosforilável ( isto é, serina ou treonina em alanina, tirosina em fenilalanina). No entanto, a produção e isolamento de proteínas mutantes é demorada. Como uma alternativa na fase inicial da pesquisa, o ensaio de peptídeo quinase competitivo é simples e conveniente. Aqui, descrevemos um protocolo para um ensaio de competição de péptidos in vitro e para a validação do local de fosforilação.
Protocol
Representative Results
Discussion
Como uma maneira simples e conveniente para avaliar a autenticidade dos locais de fosforilação previstos mediados por AMPK, aqui descrevemos um ensaio de quinase in vitro que pode ser utilizado para descobrir um local de fosforilação específico utilizando péptidos competitivos e para verificar isto utilizando um mutante específico do local . Os dados representativos obtidos a partir do ensaio de actividade de AMPK competitivo in vitro combinaram os resultados de um ensaio utilizando uma…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Pesquisa da Coréia subvenção financiada pelo governo coreano (MSIP) (nº 2015R1A2A1A10052663 e nº 2014M1A3A3A02034698).
Materials
| HEPES | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 15630 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 208337 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E3889 | |
| DTT | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D9779 | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G9422 | |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 450243 | |
| Protease inhibitor cocktail | Calbiochem, Nottingham, UK | 539134 | |
| ATP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A2383 | |
| AMP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1752 | |
| AMPK | Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY | 14-840 | |
| Nrf2 (WT) | Abnova, Taipei City, Taiwan | H00004780-P01 | |
| [γ-32P]-ATP | PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA | NEG502A | |
| EZblue staining reagent | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1041 | |
| Pfu turbo DNA polymerase | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 600250 | |
| dNTP mix | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 200415-51 | Avoid multiple thaw and freezing cycle |
| DpnI | New England Biolabs, Ipswich, MA | R0176S | |
| LB broth | Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Netherlands | L1704 | |
| Ampicillin | Affymetrix, Santa Clara, CA | 11259 | |
| Agarose LE | iNtRON Biotechnology, Sungnam, South Korea | 32034 | |
| HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit | Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan | QDF100 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 161-0400 | |
| Bovine Serum Albumin | Bovogen Biologicals, Victoria, Australia | BSA100 | |
| Glutathione Sepharose 4B | GE Healthcare, Marlborough, MA | 17-0756-01 | |
| Acetic Acid glacial | Duksan pure chemicals, Ansan, South Korea | ||
| Methyl alcohol | Daejung Chemicals & Metals, Siheung, South Korea | 5558-4410 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare, Marlborough, MA | 28-9558-09 | |
| SDS-PAGE kit | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 1658001FC | |
| Vacuum pump | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-178 | |
| Gel dryer | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-1746 | |
| Dancing shaker | FINEPCR, Seoul, Korea | CR300 | The machine is needed for washing step |
| PCR machine | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | T100 | |
| Incubator/shakers | N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Korea | NB-205L | |
| Microcentrifuges | LABOGENE, Seoul, Korea | 1730R | |
| Chromatography columns | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 732-1010 |
Referenzen
- Hardie, D. G., Schaffer, B. E., Brunet, A. AMPK: An energy-sensing pathway with multiple inputs and outputs. Trends Cell Biol. 26, 190-201 (2016).
- Gwinn, D. M., et al. AMPK phosphorylation of raptor mediates a metabolic checkpoint. Mol Cell. 30, 214-226 (2008).
- Huang, H. C., Nguyen, T., Pickett, C. B. Phosphorylation of Nrf2 at Ser-40 by protein kinase C regulates antioxidant response element-mediated transcription. J Biol Chem. 277, 42769-42774 (2002).
- Niture, S. K., Jain, A. K., Jaiswal, A. K. Antioxidant-induced modification of INrf2 cysteine 151 and PKC-delta-mediated phosphorylation of Nrf2 serine 40 are both required for stabilization and nuclear translocation of Nrf2 and increased drug resistance. J Cell Sci. 122, 4452-4464 (2009).
- Jain, A. K., Jaiswal, A. K. GSK-3beta acts upstream of Fyn kinase in regulation of nuclear export and degradation of NF-E2 related factor 2. J Biol Chem. 282, 16502-16510 (2007).
- Steen, H., Jebanathirajah, J. A., Rush, J., Morrice, N., Kirschner, M. W. Phosphorylation analysis by mass spectrometry: myths, facts, and the consequences for qualitative and quantitative measurements. Mol Cell Proteomics. 5, 172-181 (2006).
- Dephoure, N., Gould, K. L., Gygi, S. P., Kellogg, D. R. Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists. Mol Biol Cell. 24, 535-542 (2013).
- Joo, M. S., et al. AMPK facilitates nuclear accumulation of Nrf2 by phosphorylating at Serine 550. Mol Cell Biol. 36, 1931-1942 (2016).
- Sinclair, W. K., Holloway, A. F. Half-lives of some radioactive isotopes. Nature. 167 (4244), 365 (1951).
- Chang, B. Y., Chiang, M., Cartwright, C. A. The interaction of Src and RACK1 is enhanced by activation of protein kinase C and tyrosine phosphorylation of RACK1. J Biol Chem. 276, 20346-20356 (2001).
- Smith, L., et al. RACK1 interacts with filamin-A to regulate plasma membrane levels of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Am J Physiol Cell Physiol. 305 (1), C111-C120 (2013).
