الفئران قصيرة محور البطين شرائح القلب للدراسات الكهربية
Summary
هنا، نحن تصف إعداد شرائح البطين قابلة للحياة من الفئران الكبار واستخدامها للالتسجيلات المحتملة عمل القطب حادة. هذه الاستعدادات متعددة الخلايا توفر الحفاظ عليها في الجسم الحي مثل هيكل الأنسجة، مما يجعلها نموذجا قيما للدراسات الكهربية والدوائية في المختبر .
Abstract
كارديوميوسيتس الفئران استخدمت على نطاق واسع للدراسات في المختبر من علم وظائف الأعضاء القلب واستراتيجيات علاجية جديدة. ومع ذلك، الاستعدادات متعددة الخلايا من كارديوميوسيتس فصلها ليست ممثلة للمجمع في هيكل الجسم الحي من العضلية، غير ميوسيتس والمصفوفة خارج الخلية، مما يؤثر على كل من الخصائص الميكانيكية والكهربية للقلب. هنا نحن تصف تقنية لإعداد شرائح البطين قابلة للحياة من قلوب الماوس الكبار مع الحفاظ عليها في الجسم الحي مثل هيكل الأنسجة، وإثبات مدى ملاءمتها للتسجيلات الكهربية. بعد استئصال القلب، يتم فصل البطينين من الأذينين، بيرفوسد مع كا 2 + خالية من الحل يحتوي على 2،3-بوتانيديون مونوكسيم وجزءا لا يتجزأ من كتلة الاغاروز ذوبان منخفضة 4٪. يتم وضع كتلة على مشراح مع شفرة تهتز، ويتم إعداد شرائح الأنسجة مع سمك 150-400 ميكرون حفظ الاهتزاز الحرةكنسي من شفرة في 60-70 هرتز وتحريك شفرة إلى الأمام ببطء ممكن. سمك شرائح يعتمد على مزيد من التطبيق. يتم تخزين شرائح في الجليد حل تيرود البارد مع 0.9 ملي كا 2 + و 2،3-بيوتانيديون مونوكسيمي (بدم) لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، يتم نقل شرائح إلى 37 درجة مئوية دمم لمدة 30 دقيقة لغسل بدم. شرائح يمكن استخدامها للدراسات الكهربية مع أقطاب حادة أو صفائف القطب الصغير، لقياسات القوة لتحليل وظيفة مقلص أو للتحقيق في التفاعل من الخلايا الجذعية المستمدة من الخلايا الجذعية المستمدة والأنسجة المضيفة. لتسجيلات القطب حاد، يتم وضع شريحة في طبق الثقافة 3 سم ثقافة على لوحة التدفئة من المجهر المقلوب. يتم تحفيز شريحة مع القطب أحادي القطب، ويتم تسجيل إمكانات العمل داخل الخلايا من العضلية داخل شريحة مع القطب الزجاج حاد.
Introduction
وقد استخدمت شرائح الأنسجة رقيقة في كثير من الأحيان في العلوم الأساسية منذ ياماموت و مكلوين أظهرت في عام 1966 أن النشاط الكهربائي لشرائح الدماغ والحفاظ عليه في المختبر 1 . ومنذ ذلك الحين، وقد أجريت الدراسات الكهربية والدوائية على شرائح من الدماغ 2 والكبد 3 والرئة 4 وأنسجة عضلة القلب 5 و 6 و 7 . وقد وصفت التسجيلات الأولى المشبك التصحيح في شرائح البطين من قلوب الفئران حديثي الولادة في عام 1990 8 ، ولكن هذه التقنية سقطت في غياهب النسيان لبعض الوقت. بعد أكثر من عقد واحد في وقت لاحق، أنشأت مجموعتنا طريقة جديدة لإعداد الفئران الجنينية 9 ، حديثي الولادة 10 والكبار 11 شرائح القلب. هذه شرائح الأنسجة قابلة للحياة يمكن استخدامها للتجارب الحادة (شريحة الكبارق يمكن زراعتها لعدة ساعات) أو تجارب الثقافة على المدى القصير (الجنينية وشرائح الوليد يمكن زراعتها لبضعة أيام). تظهر شرائح في الجسم الحي مثل الخصائص الكهربية وانتشار الإثارة متجانسة كما تقييمها من قبل إمكانات عمل القطب حاد والتسجيلات مجموعة القطب الصغير 11 . نظرا لمورفولوجيا "ثنائي الأبعاد"، فإنها تسمح بالوصول المباشر لأقطاب التسجيل إلى جميع مناطق البطين، مما يجعلها أداة مثيرة للاهتمام للتحقيقات الكهربية ويثير خيارات تجريبية جديدة بالمقارنة مع قلوب لانجندورفف بيرفوسد كاملة. استجابة المخدرات من شرائح إلى حاصرات قناة أيون مثل فيراباميل (L- نوع كا 2 + مانع القناة)، ليدوكين (نا + مانع القناة)، 4-أمينوبيريدين (غير انتقائي تعتمد على الجهد K + قناة مانع) و لينوبيردين (كنق K + -channel بلوكر) 9 ، 11 </sup> تتوافق مع الآثار المعروفة على كارديوميوسيتس فصلها. كشفت قياسات القوة متساوي القياس علاقة إيجابية قوة التردد واقترح بقوة وظيفة مقلص سليمة 10 . وأظهرت هذه النتائج أن شرائح البطين الفئران هي مناسبة كنموذج في المختبر الأنسجة للدراسات الفسيولوجية والدوائية. وعلاوة على ذلك، شرائح البطين من قلوب المتلقي في تركيبة مع تسجيلات قطب حاد أثبتت أن تكون أداة مفيدة جدا لتوصيف التكامل الكهربائي والميكانيكية، فضلا عن نضوج الجنين المزروع 12 ، 13 ، 14 والخلايا الجذعية 15 المستمدة من الخلايا الجذعية.
باختصار، شرائح البطين هي قيمة ونموذج الأنسجة متعدد الخلايا إنشاء جيدا، وينبغي أن تعتبر مكملة ل كارديوميوسيتس فصل وقلوب لانجندورفف بيرفوسدفي أبحاث القلب والأوعية الدموية، مع ميزة كبيرة لتوفير في الجسم الحي مثل هيكل الأنسجة (على النقيض من الخلايا فصل)، وكذلك الوصول المباشر للتكنولوجيات القياس مثل تسجيلات القطب حاد لجميع مناطق القلب (على النقيض من الاستعدادات القلب كله).
Protocol
Representative Results
Discussion
شرائح البطين تمكن الكهربية والدراسات الدوائية والميكانيكية مع الحفاظ عليها في الجسم الحي مثل هيكل الأنسجة والوصول المباشر للتكنولوجيا القياس إلى جميع مناطق القلب. وقد أظهرت الخصائص الفسيولوجية العمل المحتملة في الجنينية، حديثي الولادة والشرائح الكبار <sup class=…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نقر بالدعم الذي قدمته ورش العمل والمرفق الحيوانى لمعهد الفيزيولوجيا العصبية. وأيد هذا العمل من قبل والتر أوند مارغا بول ستيفتنغ، كولن فورتشن ودويتشه ستيفتنغ فور هيرزفورسشونغ.
Materials
| Leica VT 1000s | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | Microtome with vibrating blade. | |
| Stainless Steel Blades | Campden Instruments, Loughborough, England | 7550-1-SS | |
| Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | Z627992 | |
| Fine brush, e.g. size 6 (4/32") | VWR, International, Radnor, USA | 149-2125 | |
| Preparation table | self made | ||
| Molt for embedding ventricles in agarose | self made | ||
| 1 ml Syringe | Becton, Dickinson; Franklin Lakes, USA | 300013 | |
| 27Gx3/4“ Needles | Braun, Melsungen, Germany | 4657705 | |
| 20G 11/2“ Needles | 4657519 | ||
| Small scissor | WPI, Sarasota, USA | 501263 | |
| Tweezers #5, 0.1 x 0.06 mm tip | WPI, Sarasota, USA | 500342 | |
| Oxygen gas (medical grade O2) | Linde, Munich, Germany | ||
| Carbogen gas (95 % O2, 5 % CO2) | Linde, Munich, Germany | ||
| NaCL | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 7647-14-5 | |
| KCL | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746436 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746495 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | NIST200B | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 51558 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S5761 | |
| D(+)-Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | G8270 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | M7506 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S8045 | |
| Cyanoacrylate glue | Henkel, Düsseldorf, Germany | ||
| Low-melt Agarose | Roth, Karlsruhe, Germany | 6351.2 | |
| Heparin-sodium-25000 I.E./5mL | Ratiopharm, Ulm, Germany | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX | ThermoScientific, Waltham, USA | 10566016 | |
| SEC-10LX Amplifier | npi electronic GmbH, Tamm, Germany | SEC-10LX | |
| EPC 9 | HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Germany | ||
| Zeiss Axiovert 200 | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
| Low magnification Micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | Nm-3 | |
| High magnification, three-axis micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | MHW-3 | |
| Peristaltic perfusion pump | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | PPS2 | |
| 2-channel temperature controller | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | TCO02 | |
| Square pulse stimulator | Natus Europe GmbH, Planegg, Germany | Grass SD9 | |
| Glass capillaries | WPI, Sarasota, USA | 1B150F-1 |
Referenzen
- Yamamoto, C., McIlwain, H. Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro. J Neurochem. 13, 1333-1343 (1966).
- Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Methods Mol Biol. 337, 117-125 (2006).
- Ad Graaf, I., Groothuis, G. M., Olinga, P. Precision-cut tissue slices as a tool to predict metabolism of novel drugs. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 3, 879-898 (2007).
- Kim, Y. H., et al. Cardiopulmonary toxicity of peat wildfire particulate matter and the predictive utility of precision cut lung slices. Part Fibre Toxicol. 11, 29 (2014).
- Nembo, E. N., et al. In vitro chronotropic effects of Erythrina senegalensis DC (Fabaceae) aqueous extract on mouse heart slice and pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. J Ethnopharmacol. 165, 163-172 (2015).
- Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308, H1112-H1125 (2015).
- Bussek, A., et al. Tissue slices from adult mammalian hearts as a model for pharmacological drug testing. Cell Physiol Biochem. 24, 527-536 (2009).
- Burnashev, N. A., Edwards, F. A., Verkhratsky, A. N. Patch-clamp recordings on rat cardiac muscle slices. Pflugers Arch. 417, 123-125 (1990).
- Pillekamp, F., et al. Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation. Cell Physiol Biochem. 16, 127-132 (2005).
- Pillekamp, F., et al. Neonatal murine heart slices. A robust model to study ventricular isometric contractions. Cell Physiol Biochem. 20, 837-846 (2007).
- Halbach, M., et al. Ventricular slices of adult mouse hearts–a new multicellular in vitro model for electrophysiological studies. Cell Physiol Biochem. 18, 1-8 (2006).
- Halbach, M., et al. Electrophysiological maturation and integration of murine fetal cardiomyocytes after transplantation. Circ. Res. 101, 484-492 (2007).
- Halbach, M., et al. Time-course of the electrophysiological maturation and integration of transplanted cardiomyocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 53, 401-408 (2012).
- Halbach, M., et al. Cell persistence and electrical integration of transplanted fetal cardiomyocytes from different developmental stages. Int. J. Cardiol. 171, e122-e124 (2014).
- Halbach, M., et al. Electrophysiological integration and action potential properties of transplanted cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells. Cardiovasc. Res. 100, 432-440 (2013).
- Verrecchia, F., Herve, J. C. Reversible blockade of gap junctional communication by 2,3-butanedione monoxime in rat cardiac myocytes. Am J Physiol. 272, C875-C885 (1997).
- Watanabe, Y., et al. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. Br J Pharmacol. 132, 1317-1325 (2001).
- Fleischmann, B. K., et al. Differential subunit composition of the G protein-activated inward-rectifier potassium channel during cardiac development. J Clin Invest. 114, 994-1001 (2004).
- Peinkofer, G., et al. From Early Embryonic to Adult Stage: Comparative Study of Action Potentials of Native and Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Stem Cells Dev. 25, 1397-1406 (2016).
