الإبر مخصصة لميكروينجيكشنز في الدماغ القوارض
Summary
يصف لنا هنا بروتوكولا ل microinjection في الدماغ القوارض يستخدم الكوارتز الإبر. هذه الإبر لا تنتج تلف الأنسجة القابلة للكشف والتأكد من تسليم موثوق بها حتى في المناطق العميقة. وعلاوة على ذلك، يمكن تكييفها وفقا لاحتياجات البحوث بتصاميم شخصية، ويمكن إعادة استخدام.
Abstract
وقد استخدمت ميكروينجيكشنز لفترة طويلة لإيصال المخدرات أو السموم داخل مناطق محددة من الدماغ، وفي الآونة الأخيرة، فقد استخدمت لتقديم منتجات العلاج بالجينات أو الخلايا. لسوء الحظ، استخدام التقنيات الحالية التي microinjection الإبر الفولاذية أو الزجاجية التي دون المستوى الأمثل لأسباب متعددة: الإبر الصلب قد يسبب تلف الأنسجة بوجه خاص، وقد ثني الإبر الزجاج عندما خفضت عميق في الدماغ، والمنطقة المستهدفة في عداد المفقودين. في هذه المقالة، نحن تصف وضع بروتوكول لإعداد واستخدام الإبر الكوارتز التي تجمع بين عدد من الميزات المفيدة. لا تنتج هذه الإبر تلف الأنسجة القابلة للاكتشاف، ويجري صارم جداً، ضمان التسليم موثوق بها في منطقة الدماغ المطلوب حتى عند استخدام الإحداثيات العميق. وعلاوة على ذلك، فمن الممكن لتخصيص تصميم الإبرة بأحداث فتحات متعددة للقطر المطلوب. ثقوب متعددة تسهل ضخ كميات كبيرة من حل داخل مساحة أكبر، بينما ثقوب كبيرة تيسير حقن الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تنظيف هذه الإبر الكوارتز وإعادة استخدامها، مثل أن تصبح الإجراءات فعالة من حيث التكلفة.
Introduction
استخدمت ميكروينجيكشنز لفترة طويلة لتسليم مركبات عقاقيري النشط لتعدل نشاط الخلايا العصبية في مناطق معينة من الدماغ. وباﻹضافة إلى ذلك، فقد استخدمت لحقن السموم قرب السكان العصبية خاصة، لتقليد الأعصاب الأحداث المميزة لبعض الأمراض، على سبيل المثال 6-هيدروكسي-الدوبامين في نظام الدوبامين نيجروسترياتال لتقليد مرض باركنسون 1 , 2 أو سابورين مفتش immunotoxin 192 على آفة نظام اتروبين3. في الآونة الأخيرة، استخدمت microinjection إجراءات لتسليم الطعوم ناقلات أو الخلايا الفيروسية للعلاج بالجينات أو الخلايا من اضطرابات الدماغ التجريبية4،5.
نوع الإبر المستخدمة في هذه الدراسات الكلاسيكية مصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ. على الرغم من السهل والعملي لاستخدام الإبر الصلب لديها عدد من المشاكل6: هي كبيرة نسبيا وقد يسبب تلف الأنسجة، مع تسرب حاجز الدم في الدماغ وتنشيط astrocytes؛ علاوة على ذلك، فإنها قد تنتج الحفر من أنسجة المخ الذي يحصل في الإبرة خلق عقبة أو حتى تماما تجنب تدفق الحل المنشود. في الآونة الأخيرة، استخدام الإبر الزجاج أدخلت مستعدين المخصص من الشعيرات الدموية في7،8. هذه لا تسبب تنشيط أنسجة كبيرة الضرر ولا أستروسيتي، بل هي مرنة نسبيا وقد ينحني عند عرضه في هياكل العميق، وتقليل دقة الترجمة (الملاحظات الشخصية).
ولذلك هناك حاجة تقليل قدر الضرر المحتمل (خاصة عند إجراء التجارب لمداواة الضرر) مع زيادة الدقة وإمكانية تكرار نتائج (أي، ضمان أن يتم تسليم كل حل والترجمة الصحيحة). وعلاوة على ذلك، سيكون من المرغوب فيه استخدام تصاميم مختلفة الإبرة لضمان التوزيع الأمثل للحل حقن في مناطق الدماغ مع الهندسات متفاوتة. في هذه المقالة، نحن تصف وضع بروتوكول لإعداد واستخدام الإبر الكوارتز ميكروينجيكتيونس في الدماغ القوارض. بسبب نقطة انصهار عالية، الكوارتز الشعيرات الدموية لا يمكن سحبها على ساحبة تقليدية ولذلك لا قد استخدمت في الماضي لتوليد الإبر. ومع ذلك، يوفر الكوارتز، بعض المزايا الهامة عبر الزجاج، ولا سيما ارتفاع صلابة وكسر المقاومة9. بسبب تلك الصلابة، الإبر الكوارتز هي مناسبة بشكل مثالي للحقن في مناطق الدماغ البطني. بسبب مقاومتها عالية للكسر أنها يمكن أن تكون على غرار لتشمل عدة ثقوب، الحصول على التصاميم التي قد تكون الأكثر فعالية حتى عند استهداف مناطق الدماغ مع مجمع الهندسيات10.
Protocol
Representative Results
Discussion
الأسلوب الموصوفة في هذه المقالة يفي بالاحتياجات الواردة في مقدمة للاستفادة المثلى من ميكروينجيكشنز التي يتم تنفيذها لمختلف الأغراض12. الإبر الموصوفة هنا تقليل الضرر إلى مستوى الحد الأدنى، وأساساً غير القابلة للاكتشاف؛ في تباين مع الإبر الزجاجية (التي عرضه لثني)، ال…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعمت هذا العمل بمنحه مقدمة من “الجماعة الأوروبية” [مشروع FP7–الناس–2011–IAPP 285827 (ابيكستشانجي)].
Materials
| Quartz capillaries | Sutter Instruments, Novato, CA USA | Q100-50-10 | Without filament |
| Puller | Sutter | P2000 | |
| Micropipette storage jar | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | E210 | |
| Laser microdissector | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | LMD6500 | |
| Hamilton syringe | Hamilton ILS Innovative Labor Systeme GmbH, StŸtzerbach, Germany | 19138-U | |
| Microinfusion pump | Univentor, Zejtun, Malta | Model 864 | |
| Manual microinjection pump kit | WPI | Item#: MMP-KIT | Kit allowing for micropipettes to be securely mounted to the stereotactic frame |
| Precision Drill | Proxxon | 28510 MicroMot 50/E | Ball bearing drive shaft with variable speed |
| Artficial Cerebral Spinal Fluid | Tocris | 3525 | |
| Needles 26 G Blunt and 30 G Bevel | Hamilton | 26 G Blunt: 19138-U 30 G Bevel: 20757 |
|
| Microtome | Leica, Germany | LEICA RM212RT |
Referenzen
- Kirik, D., Rosenblad, C., Björklund, A. Characterization of behavioral and neurodegenerative changes following partial lesions of the nigrostriatal dopamine system induced by intrastriatal 6-hydroxydopamine in the rat. Exp Neurol. 152 (2), 259-277 (1998).
- Paolone, G., Brugnoli, A., Arcuri, A., Mercatelli, D., Morari, M. Eltoprazine prevents levodopa-induced dyskinesias by reducing striatal glutamate and direct pathway activity. Mov Disord. 30 (13), 1728-1738 (2015).
- Paolone, G., Lee, T. M., Sarter, M. Time to pay attention: attentional performance time-stamped prefrontal cholinergic activation, diurnality, and performance. J Neurosci. 32 (35), 12115-12128 (2012).
- Shoichet, M. S., Winn, S. R. Cell delivery to the central nervous system. Adv Drug Deliv Rev. 42, 81-102 (2000).
- Simonato, M., et al. Progress in gene therapy for neurological disorders. Nature RevNeurol. 9, 277-291 (2013).
- Björklund, H., Olson, L., Hahl, D., Schwarcz, R. Short-and Long-Term Consequences of Intracranial Injections of the Excitotoxin, Quinolinic Acid, as Evidenced by GFA Immunohistochemistry of Astrocytes. Brain Res. 317, 267-277 (1986).
- Paradiso, B., et al. Localized delivery of fibroblast growth factor-2 and brain-derived neurotrophic factor reduces spontaneous seizures in an epilepsy model. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7191-7196 (2009).
- Falcicchia, C., et al. Silencing Status Epilepticus-Induced BDNF Expression with Herpes Simplex Virus Type-1 Based Amplicon Vectors. PLoS One. 11 (3), 1-17 (2016).
- Munoz, J. L., Coles, J. A. Quartz micropipettes for intracellular voltage microelectrodes and ion-selective microelectrodes. J Neurosci Meth. 22 (1), 57-64 (1987).
- Kilkenny, C., Browne, W., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines. J Cereb Blood Flow Metab. 31, 991-993 (2011).
- Torres, E. M., Trigano, M., Dunnett, S. B. Translation of cell therapies to the clinic: characteristics of cell suspensions in large-diameter injection cannulae. Cell Transplant. 24, 737-749 (2015).
