배아 운동 뉴런의 Axonal 투영 패턴의 시각화<em> Drosophila</em
Summary
이 연구는 후기 단계 -16 Drosophila melanogaster 배아의 운동 뉴런 예측을 시각화하기위한 표준 면역 조직 화학 법을 상세히 설명합니다. FasII 항체로 염색 된 고정 배아의 필렛 된 준비는 신경 발달 중에 모터 축삭 돌연변이 및 표적인지에 필요한 유전자를 특성화하는 강력한 도구를 제공한다.
Abstract
기능적 신경근 회로의 구축은 모터 축색 돌기와 표적 근육의 정확한 연결에 의존한다. 모터 뉴런은 주변 세포 외 환경에서 발생하는 많은 수의 축색 유도 신호에 반응하여 특정 경로를 따라 이동하기 위해 성장 원뿔을 확장시킵니다. 성장 원뿔 표적 인식은 또한 신경근 특이성에 중요한 역할을합니다. 이 연구는 후기 무대 16 Drosophila melanogaster 배아의 운동 뉴런 예측을 시각화하기위한 표준 immunohistochemistry 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜에는 원하는 돌연변이 배아를 분류하기위한 genotyping 절차를 포함한 몇 가지 주요 단계가 포함되어 있습니다. 배아에 fasciclin II (FasII) 항체를 표지하기위한 면역 염색 절차; 및 해부 절차, 고정 배아에서 filleted 준비를 생성합니다. 말초의 모터 축삭 돌기 및 근육 패턴은 filleted embryos의 편평한 준비 과정에서 wh보다 훨씬 더 잘 시각화됩니다올레 – 마운트 배아. 따라서, FasII 항체로 염색 된 고정 배아의 필렛 된 준비는 모터 축색 돌연변이 및 표적 인식에 필요한 유전자를 특성화하기위한 강력한 도구를 제공하며, 기능 상실 및 기능 상실 유전 스크린 모두에 적용될 수있다 .
Introduction
배아 발생 과정에서 모터 축삭과 표적 근육 사이의 정확하고 선택적 연결은 Drosophila 애벌레의 정상적인 이동에 필수적 입니다. 복부 hemisegment A2-A7 각각에서 30 개의 근육 섬유의 배아 패터닝은 단계 16 1 에 의해 확립된다. 복부 신경 코드에서 생성 된 36 개의 운동 뉴런은 축삭을 주변으로 확장시켜 특정 표적 근육을 신경 자극합니다 2 . 모터 축색 돌연변이와 표적인지는 항체 (마우스 단클론 항체 1D4) 3 , 4로 면역 조직 화학으로 시각화 할 수 있습니다. 야생형 배아에서 모터 축삭 돌기 패턴의 다중 이미지는 웹 5에서 사용할 수 있습니다. 1D4 항체는 배아 중추 신경계 (CNS) 4 정중선의 각 측면에있는 모든 모터 축삭 및 세 개의 세로축 축삭 줄기를 표시합니다 </sup> , 6 ( 도 1C 및 도 2A ). 따라서 FasII 항체를 이용한 면역 조직 화학은 운동 축삭 유도 및 표적 인식의 기본이되는 분자 메커니즘을 증명하기 위해 신경근 연결에 필요한 유전자를 확인하는 강력한 도구를 제공합니다.
복부 hemisegments A2-A7의 각각에서, 모터 축삭 돌기는 2 개의 주요한 신경 가지로 분열 신경 (SN) 및 intersegmental 신경 (ISN) 2 및 4 , 및 작은 신경 분기, TN ) 7 . SN은 ISN, ISNb 및 ISNd 2 , 4 라고 불리는 3 개의 신경 가지로 분할하는 반면, SN은 선택적으로 탈 섬유되어 두 개의 신경 가지 인 SNa 및 SNc를 발생시킵니다. 그 중에서도 ISN, ISNb 및 SNa 모터 축삭투상 패턴은 말기 16 기 배아가 FasII 항체로 염색되고 필렛 처리되면 가장 정확하게 시각화됩니다 ( 그림 1C 및 그림 2A ). ISN 운동 뉴런은 축삭을 등쪽 근육 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 18, 19, 20 2 , 4 ( 그림 2A )를 자극하도록 확장시킵니다. ISNb 모터 뉴런은 6, 7, 12, 13, 14, 28 및 30 2 , 4 ( 그림 2A 및 2B)의 복근 근육을 자극합니다. SNa 신경 가지는 측면 근육 5, 8, 21, 22, 23 및 24 2 , 4 ( 그림 2A )에 신경을 작용하도록 돌출합니다. 두 모터 엑손으로 구성된 TN은 근육을 자극 할 수 있도록 분절 경계를 따라 일 측적으로 돌출하고, 근육에서 신경 양측 신경근 (lateral bipolar dendritic neuron, LBD)과 시냅스를 만든다.( 도 7 ). 이러한 목표 근육 내향은 특정 선택 지점에서 모터 축삭의 선택적 탈 섬유화뿐만 아니라 근육 인식을 목표로합니다. 또한, 중간 표적으로 작용하는 일부 추정 중배엽 안내 표지 세포는 ISN 및 SNa 경로 모두에서 발견되었지만 ISNb 경로에서는 발견되지 않았다. 이것은 ISNb 모터 축삭 길 찾기가 ISN 및 SNa 모터 축삭 유도와 비교하여 뚜렷한 방식으로 조절 될 수 있음을 시사하며, 또한 말초 모터 축삭 유도가 단일 안내 큐의 차별적 인 또는 보존 된 역할을 연구하기위한 매력적인 실험 모델을 제공한다는 것을 나타낸다 분자 8 .
이 작품은 Drosophila에서 배아 운동 뉴런의 axonal 투영 패턴을 시각화하는 표준 방법을 제공합니다. 설명한 프로토콜은 1D4로 얼룩진 고정 배아를 해부하는 방법을 포함filtted 제제의 경우 3,3'- 디아 미노 벤지딘 (DAB)으로 가공한다. 고정 배아의 편평한 준비의 한 가지 중요한 이점은 주변에서 축삭 돌기 및 근육 패턴의 더 나은 시각화입니다. 또한,이 작품은 또한 LacZ 얼룩 방법을 사용하여 원하는 돌연변이 배아를 정렬 고정 배아를 유전자형하는 방법을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
모터 축색 돌연변이 결함의 세부 사항은 DAB로 얼룩진 배아의 filleted 준비가 형광으로 표시된 것들의 공 촛점 현미경 검사보다 더 빠르고 정확도가 높습니다. 따라서, 고정 및 1D4 얼룩 배아의 필렛 된 준비는 안내 큐 분자의 기능적 특성 결정에 가장 적합합니다. 넷린, 슬릿, 세마포린 (semas) 및 에프 린을 비롯한 네 가지 주요 안내 단서와 그 동족 수용체는 웜, 파리 및 척추 동물을 통해 진화 적으로 …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alex L. Kolodkin에게 감사의 말을 전합니다. 그의 실험실에서이 필렛 준비 프로토콜을 배웠습니다. 홍영기 씨에게도 기술 지원에 감사드립니다. 이 연구는 NRF-2013R1A1A4A01011329 (SJ)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| 16% Paraformaldehyde Solution | Ted Pella | 18505 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | 71500 | |
| X-Gal Substrate | US Biological | X1000 | X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside) |
| Dimethyl Sulfxide | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Potassium hexacyanoferrate(III) | Sigma-Aldrich | 244023 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| 3,3'-diaminobenzidine Tetrahydrochloride | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| Agar | US Biological | A0930 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate) | Sigma-Aldrich | H5501 | |
| Culture Dish (60 mm) | Corning | 430166 | |
| Tricon Beaker | Simport | B700-100 | This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection. |
| Yeast | Societe Industrielle Lesaffre | Saf Instant Yeast Red | |
| Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100) | VWR | 14220-263 | |
| Eppendorf Tube (1.5 ml) | Sarstedt | #72.690 | |
| Bleach | The Clorox Company | Clorox | |
| Heptane | Sigma-Aldrich | 246654 | |
| Methanol | J.T. Baker | UN1230 | |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Anti-FasciculinII Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4 anti-Fasciclin II | |
| Goat Anti-mouse-HRP Antibody | Jackson Immunoresearch | 115-006-068 | AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L) (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Slide Glass | Duran Group | 235501403 | |
| Coverslip | Duran Group | 235503104 | 18 x 18 mm |
| 1 ml Syringe | Becton Dickinson Medical(s) | 301321 | |
| Tungsten Needle | Ted Pella | #27-11 | Tungsten Wire, ø0.13mm/6.1m (ø.005"/20 ft.) |
| Nutator (Mini twister) | Korean Science | KO.VS-96TWS | Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125) |
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