Embriyonik Motor Nöronlarının Aksonal Projeksiyon Paterninin Görselleştirilmesi<em> Drosophila</em
Summary
Bu çalışma, geç evre-16 Drosophila melanogaster embriyolarının motor nöron projeksiyonlarını görselleştirmek için standart bir immünohistokimya yöntemini ayrıntılarıyla anlatıyor . FasII antikoru ile lekelenmiş sabit embriyoların filleted hazırlığı, motor akson yol bulma ve sinirsel gelişim sırasında hedef tanıma için gerekli genlerin karakterize edilmesi için güçlü bir araç sağlar.
Abstract
Fonksiyonel nöromüsküler devrelerin oluşturulması motor aksonlar ve hedef kaslar arasındaki hassas bağlantılara dayanır. Motor nöronları, çevredeki hücre dışı ortamdan çıkan çok sayıda akson rehberliğine yanıt olarak spesifik yol boyunca gezinmek için büyüme konilerini uzatır. Büyüme konisi hedef tanıma da nöromüsküler özgüllükte kritik bir rol oynamaktadır. Bu çalışma, geç evre-16 Drosophila melanogaster embriyolarının motor nöron projeksiyonlarını görselleştirmek için standart bir immünohistokimya protokolü sunmaktadır . Bu protokol, istenen mutant embriyoları sıralamak için bir genotiplendirme prosedürü de dahil olmak üzere birkaç temel adım içerir; Fasciclin II (FasII) antikoru ile embriyoların etiketlenmesi için bir imüno boyama prosedürü; Ve sabit embriyolardan dolgulu preparatların üretilmesi için bir diseksiyon prosedürü. Çevredeki motor akson projeksiyonları ve kas desenleri, fileto embriyoların yassı preparatlarında daha iyi görselleştirilirOle-mount embriyolar. Bu nedenle, FasII antikoru ile boyanmış sabit embriyoların filleted hazırlığı, motor akson yol bulma ve hedef tanıma için gerekli genleri karakterize etmek için güçlü bir araç sağlar ve hem fonksiyon kaybı hem de işlev kazanım genetik ekranlarına da uygulanabilir .
Introduction
Embriyonik gelişme esnasında motor aksonlar ve hedef kaslar arasındaki hassas ve seçici bağlantılar, Drosophila larvalarında normal hareket için gereklidir . Karın hemisiyasyon A2-A7'nin her birinde 30 kas lifinin embriyonik desenlenmesi, evre 16 1 ile oluşturulmuştur. Ventral sinir kablosunda üretilen 36 motor nöron, spesifik hedef kasları innerve etmek için aksonları periferiye uzatır. Motor akson yol bulma ve hedef tanıma, bir antikor (fare monoklonal antikor 1D4) 3 , 4 ile immünohistokimya ile görselleştirilebilir. Vahşi embriyolardaki motor akson projeksiyon modellerinin çoklu görüntüleri web 5'de mevcuttur. 1D4 antikoru, tüm motor aksonları ve üç uzunlamasına akson fasikülünü embriyonik merkezi sinir sisteminin (CNS) orta çizgisinin her iki yanına etiketliyor </sUp> , 6 ( Şekil 1C ve Şekil 2A ). Bu nedenle, FasII antikoru ile immünohistokimya, motor akson rehberlik ve hedef tanıma altında yatan moleküler mekanizmaları göstermek için nöromüsküler bağlantı için gerekli genlerin belirlenmesi için güçlü bir araç sağlar.
Motor aksonlar, A2-A7 abdominal hemizasyondan her birinde, iki ana sinir dalına, segmental sinir (SN) ve intersegmental sinir (ISN) 2 , 4'e ve küçük sinir dalına, transvers siniri (TN ) 7 . SN, seçici olarak, SNa ve SNc olarak adlandırılan iki sinir dalına neden olurken, ISN, ISN, ISNb ve ISNd 2 , 4 olarak adlandırılan üç sinir dalına bölünür. Bunların arasında ISN, ISNb ve SNa motor aksonGeç evre-16 embriyoları FasII antikoru ile boyandığında ve fileto edildiğinde ( Şekil 1C ve Şekil 2A ), projeksiyon desenleri en net şekilde görselleştirilir. ISN motor nöronları aksonlarını 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 18, 19 ve 20 2 , 4 ( Şekil 2A ) dorsal kaslarını innerve etmek için uzatır. ISNb motor nöronları ventrolateral kasları 6, 7, 12, 13, 14, 28 ve 30 2 , 4'te sinirlendirir ( Şekil 2A ve 2B). SNa sinir dalı yanal kasları 5, 8, 21, 22, 23 ve 24 2 , 4'ü sinirlendirmek için projelendirir ( Şekil 2A ). İki motor aksondan oluşan TN, kas 25'i sinirlendirmek için segmental sınır boyunca ipsilateral olarak projeler ve sinir sisteminde lateral bipolar dendritik nöron (LBD) ile sinapslar oluşturur.Çevre 7 ( Şekil 2A ). Bu hedef kas innervasyonları, spesifik seçim noktalarında motor aksonların seçici defasikasyonunu değil, aynı zamanda kasların tanınmasını da gerektirir. Buna ek olarak, ara hedef olarak işlev gören bazı varsayılan mezodermal kılavuz hücreler ISN ve SNa yolaklarında bulunmuştur, ancak ISNb yolu 4 boyunca bulunmamıştır. Bu, ISNb motor akson yol bulma yönteminin, ISN ve SNa motor akson rehberliğine kıyasla ayrı bir şekilde düzenlenebileceğini ve aynı zamanda periferik motor akson kılavuzluğunun, tek bir rehberlik işaretinin farklı veya korunmuş rollerini incelemek için çekici bir deneysel model sunduğunu gösterir Molekül 8 .
Bu çalışma, Drosophila'daki embriyonik motor nöronların aksonal projeksiyon modellerini görselleştirmek için standart bir yöntem sunmaktadır . Açıklanan protokoller, 1D4 ile lekelenmiş sabit embriyolarınNtibody ile doldurulmuş ve filleted preparatlar için 3,3'-diaminobenzidine (DAB) işlenmiştir. Sabit embriyoların düz preparatlarının kritik bir avantajı, çevresindeki aksonal projeksiyonların ve kas modellerinin daha iyi görselleştirilmesidir. Ayrıca, bu çalışma aynı zamanda istenen mutant embriyoları LacZ boyama yöntemini kullanarak sıralamak için sabit embriyoların genotiplendirilmesini de gösterir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Motor akson rehberliğinde kusurların ayrıntıları, DAB lekeli embriyoların örtülü hazırlanmasıyla, flüoresan etiketli olanların konfokal mikroskobunda lazer taramasından daha hızlı ve daha doğru bir şekilde skorlanır. Dolayısıyla, sabit ve 1D4 ile boyanmış embriyoların dolgulu hazırlanması en iyi kılavuzluk ipucu moleküllerinin fonksiyonel karakterizasyonu için uygundur. Netrinler, Yarıklar, semaforinler (Semas) ve efrinler ile bunların ortak kökenli reseptörleri de dahil olmak üzere dö…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alex L. Kolodkin'e teşekkür ediyorum, laboratuvarımdaki bu dolgulu hazırlık protokolünü öğrendim. Teknik yardım için Young Gi Hong'a da teşekkür ediyorum. Bu çalışma NRF-2013R1A1A4A01011329 (SJ) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| 16% Paraformaldehyde Solution | Ted Pella | 18505 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | 71500 | |
| X-Gal Substrate | US Biological | X1000 | X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside) |
| Dimethyl Sulfxide | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Potassium hexacyanoferrate(III) | Sigma-Aldrich | 244023 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| 3,3'-diaminobenzidine Tetrahydrochloride | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| Agar | US Biological | A0930 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate) | Sigma-Aldrich | H5501 | |
| Culture Dish (60 mm) | Corning | 430166 | |
| Tricon Beaker | Simport | B700-100 | This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection. |
| Yeast | Societe Industrielle Lesaffre | Saf Instant Yeast Red | |
| Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100) | VWR | 14220-263 | |
| Eppendorf Tube (1.5 ml) | Sarstedt | #72.690 | |
| Bleach | The Clorox Company | Clorox | |
| Heptane | Sigma-Aldrich | 246654 | |
| Methanol | J.T. Baker | UN1230 | |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Anti-FasciculinII Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4 anti-Fasciclin II | |
| Goat Anti-mouse-HRP Antibody | Jackson Immunoresearch | 115-006-068 | AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L) (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Slide Glass | Duran Group | 235501403 | |
| Coverslip | Duran Group | 235503104 | 18 x 18 mm |
| 1 ml Syringe | Becton Dickinson Medical(s) | 301321 | |
| Tungsten Needle | Ted Pella | #27-11 | Tungsten Wire, ø0.13mm/6.1m (ø.005"/20 ft.) |
| Nutator (Mini twister) | Korean Science | KO.VS-96TWS | Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125) |
Referenzen
- Bate, M. The embryonic development of larval muscles in Drosophila. Development. 110 (3), 791-804 (1990).
- Landgraf, M., Thor, S. Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology. Semin. Cell Dev. Biol. 17 (1), 3-11 (2006).
- Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule. Cell. 67 (1), 45-57 (1991).
- Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila. Cell. 73 (6), 1137-1153 (1993).
- . Available from: https://www.its.caltech.edu/~zinnlab/motoraxons.html (2017)
- Seeger, M., Tear, G., Ferres-Marco, D., Goodman, C. S. Mutations affecting growth cone guidance in Drosophila: genes necessary for guidance toward or away from the midline. Neuron. 10 (3), 409-426 (1993).
- Thor, S., Thomas, J. B. The Drosophila islet gene governs axon pathfinding and neurotransmitter identity. Neuron. 18 (3), 397-409 (1997).
- Roh, S., Yang, D. S., Jeong, S. Differential ligand regulation of PlexB signaling in motor neuron axon guidance in Drosophila. Int. J. Dev. Neurosci. 55, 34-40 (2016).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. . The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (1985).
- Patel, N. H., Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods in cell biology, vol 44. Drosophila melanogaster: practical uses in cell biology. 44, 445-487 (1994).
- Lee, H. K., Wright, A. P., Zinn, K. Live dissection of Drosophila embryos: streamlined methods for screening mutant collections by antibody staining. J. Vis. Exp. (34), (2009).
- Hartenstein, V. Stages of Embryonic Development. Atlas of Drosophila. development. , 52 (1993).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull. World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
- Kolodkin, A. L. Fasciclin IV: sequence, expression, and function during growth cone guidance in the grasshopper embryo. Neuron. 9 (5), 831-845 (1992).
- Jeong, S., Juhaszova, K., Kolodkin, A. L. The Control of semaphorin-1a-mediated reverse signaling by opposing pebble and RhoGAPp190 functions in Drosophila. Neuron. 76 (4), 721-734 (2012).
- Winberg, M. L. Plexin A is a neuronal semaphorin receptor that controls axon guidance. Cell. 95 (7), 903-916 (1998).
- Yang, D. S., Roh, S., Jeong, S. The axon guidance function of Rap1 small GTPase is independent of PlexA RasGAP activity in Drosophila. Dev. Biol. 418 (2), 258-267 (2016).
- Yu, H. H., Araj, H. H., Ralls, S. A., Kolodkin, A. L. The transmembrane Semaphorin Sema I is required in Drosophila for embryonic motor and CNS axon guidance. Neuron. 20 (2), 207-220 (1998).
- Hartenstein, V. Stages of Embryonic Development. Atlas of Drosophila. development. , 52 (1993).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Kidd, T. Roundabout controls axon crossing of the CNS midline and defines a novel subfamily of evolutionarily conserved guidance receptors. Cell. 92 (2), 205-215 (1998).
- Pasterkamp, R. J. Getting neural circuits into shape with semaphorins. Nat. Rev. Neurosci. 13 (9), 605-618 (2012).
