В анализах in vitro для оценки образования и разрушения сосудов типа мозгового барьера
Summary
Поддержание охвата кроветворного мозга является ключевым фактором гомеостаза центральной нервной системы. Этот протокол описывает методы in vitro для определения фундаментальных и патологических процессов, которые модулируют покрытие гематоэнцефалического барьера.
Abstract
Охват гематоэнцефалического барьера (ВВВ) играет центральную роль в гомеостазе центральной нервной системы (ЦНС). BBB динамически поддерживается астроцитами, перицитами и эндотелиальными клетками мозга (BECs). Здесь мы подробно описываем методы оценки охвата ВВВ с использованием единых культур увековеченных человеческих BEC, одиночных культур первичных мышей BEC и гуманизированной модели тройной культуры (BEC, астроциты и перициты) BBB. Чтобы подчеркнуть применимость анализов к болезненным состояниям, мы описываем эффект олигомерного амилоида-β (oAβ), который является важным фактором развития болезни Альцгеймера (AD) при охвате BBB. Кроме того, мы используем эпидермальный фактор роста (EGF), чтобы осветить потенциал скрининга лекарственного средства этих методов. Наши результаты показывают, что одиночные и тройные культивированные BEC формируют сетчатые структуры в базовых условиях и что oAβ разрушает это образование ячеистых ячеек и дегенерирует предварительно сформированные сетчатые структуры,Но EGF блокирует это нарушение. Таким образом, описанные методы важны для анализа фундаментальных и связанных с заболеванием процессов, которые модулируют покрытие ВВВ.
Introduction
Гематоэнцефалический барьер (ВВВ) мозговых капилляров является самым большим связующим звеном между контактом крови и мозга и играет центральную роль в гомеостазе центральной нервной системы (ЦНС) 1 , 2 . Динамические процессы на BBB предотвращают поглощение нежелательных молекул из крови, удаляют отходы из ЦНС, подают необходимые питательные вещества и сигнальные молекулы в ЦНС и модулируют нейровоспаление 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Ущерб ВВВ распространен во время старения и несколько нейродегенеративных расстройств, включая болезнь Альцгеймера (AD), рассеянный склероз и инсульт 1 , 2 , 3 , 4 , 5 ,Ass = "xref"> 6. Следовательно, дисфункция ВВВ может играть ключевую роль в нейродегенеративных нарушениях, в том числе в качестве терапевтической цели.
Сохранение покрытия судна важно для гомеостатических функций ВВВ. Тем не менее, in vivo и in vitro данные противоречат тому, являются ли процессы, связанные с нейродегенеративными нарушениями, более высоким или более низким охватом BBB 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , особенно в AD. Таким образом, существует сильное обоснование для разработки моделей in vitro с использованием соответствующих типов клеток для оценки и более всестороннего понимания динамики охвата ВВВ. Церебральные капилляры состоят из астроцитов, перицитов и эндотелиальных клеток мозга (BECs) <sUp class = "xref"> 3. Все типы клеток вносят вклад в функцию ВВВ через структурную поддержку и посредством секреции эффекторных молекул, таких как ангиогенные факторы роста, цитокины и хемокины, которые действуют как паракрин- и аутокриноподобный. Однако основными эффекторными ячейками ВВВ являются БЭК 3 . В общем, методы клеточной культуры для оценки функции ВВВ представляют собой анализы проницаемости, проводимые на клетках, выращенных на фильтрационных вставках, или на оценку уровней ключевых белков BEC как после добавления стрессоров 14 , 15 , 16 . Хотя важно, эти анализы не фокусируются на охвате мозгового кровообращения.
Здесь наши предыдущие методы 17 подробно описаны для оценки охвата BEC и структур, подобных сетке, с использованием единых культур увековеченных человеческих BEC, одиночных культур первичных мышей BEC и гуманизированной тройной культуры(БЭК, астроциты и перициты) ВВВ. Целью было продемонстрировать пагубное влияние oAβ, которое считается важным фактором развития AD, на покрытие BEC. Защитный эффект эпидермального фактора роста (EGF) подчеркивает потенциал метода в качестве терапевтического инструмента для скрининга. Этот метод имеет несколько широких применений для фундаментальных и прикладных исследований, в том числе: 1) определение роли конкретных путей ангиогенеза и покрытия сосудов; 2) оценка влияния болезней и факторов, связанных с старением, на ангиогенез и покрытие сосудов; 3) выявление фармакологических цели.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанные методы могут быть использованы для решения ряда фундаментальных биологических вопросов, связанных с охватом мозгового кровообращения 24 . В частности, они могут идентифицировать, какие рецепторы и сигнальные пути играют роль в ангиогенезе, покрытии сосудов в ра?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Леон Тай финансируется фондами начальных фондов Чикагского университета штата Иллинойс.
Materials
| hCMEC/D3 cells | Milipore | SCC066 | |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | |
| Collagen Type 1 | ThermoFisher | A1064401 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025092 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14175095 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
| Final concentrations of the SingleQuot growth factor supplements for EBM2 media | Lonza | CC-4147 | |
| 5% FBS | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Ascorbic acid | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Gentamycin sulphate | Lonza | CC-4147 | |
| 25% Hydrocortisone | Lonza | CC-4147 | |
| 1/4 volume of the supplied growth factors: fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor | Lonza | CC-4147 | |
| Puromycin hydrochloride | VWR | 80503-312 | |
| MEM-HEPES | Thermo Scientific | 12360-038 | |
| Papain cell dissociation system (papain and DNase1) | Worthington Biochemical | LK003150 | |
| Human pericytes | Sciencell | 1200 | |
| Pericyte basal media | Sciencell | 1201 | |
| Pericyte growth supplement | Sciencell | 1252 | |
| Human Astrocytes | Sciencell | 1800 | |
| Astrocyte media | Sciencell | 1801 | |
| Astrocyte growth supplement | Sciencell | 1852 | |
| Basement membrane (Matrigel Growth Factor Reduced) | Corning | 356231 | |
| Angiogenesis m-plates (96-well) | ibidi | 89646 | |
| Human Epidermal growth factor | Shenendoah Biotechnology | 100-26 | |
| CellTracker green | ThermoFisher | C7025 | |
| CellTracker orange | ThermoFisher | C34551 | |
| CellTracker blue | ThermoFisher | C2110 | |
| Poly-l-lysine | Sciencell | 0403 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT5012-60ML | |
| C57BL mice | Jackson Laboratory | na | |
| PCR tube strips | GeneMate | T-3014-2 | |
| Zeiss stereo discover v.8 dissecting microscope | Zeiss | na |
Referenzen
- Abbott, N. J. Blood-brain barrier structure and function and the challenges for CNS drug delivery. J Inherit Metab Dis. 36 (3), 437-449 (2013).
- Engelhardt, B., Liebner, S. Novel insights into the development and maintenance of the blood-brain barrier. Cell Tissue Res. 355 (3), 687-699 (2014).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).
- Zlokovic, B. V. Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer’s disease and other disorders. Nat Rev Neurosci. 12 (12), 723-738 (2011).
- Pardridge, W. Targeted delivery of protein and gene medicines through the blood-brain barrier. Clin Pharmacol Ther. 97 (4), 347-361 (2014).
- Tai, L. M., et al. The role of APOE in cerebrovascular dysfunction. Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).
- Biron, K. E., Dickstein, D. L., Gopaul, R., Jefferies, W. A. Amyloid triggers extensive cerebral angiogenesis causing blood brain barrier permeability and hypervascularity in Alzheimer’s disease. PLoS One. 6 (8), e23789 (2011).
- Cameron, D. J., et al. Alzheimer’s-related peptide amyloid-beta plays a conserved role in angiogenesis. PLoS One. 7 (7), e39598 (2012).
- Boscolo, E., et al. Beta amyloid angiogenic activity in vitro and in vivo. Int J Mol Med. 19 (4), 581-587 (2007).
- Paris, D., et al. Impaired angiogenesis in a transgenic mouse model of cerebral amyloidosis. Neurosci Lett. 366 (1), 80-85 (2004).
- Kitaguchi, H., Ihara, M., Saiki, H., Takahashi, R., Tomimoto, H. Capillary beds are decreased in Alzheimer’s disease, but not in Binswanger’s disease. Neurosci Lett. 417 (2), 128-131 (2007).
- Jantaratnotai, N., Ryu, J. K., Schwab, C., McGeer, P. L., McLarnon, J. G. Comparison of Vascular Perturbations in an Abeta-Injected Animal Model and in AD Brain. Int J Alzheimers Dis. 2011, 918280 (2011).
- Donnini, S., et al. Abeta peptides accelerate the senescence of endothelial cells in vitro and in vivo, impairing angiogenesis. FASEB J. 24 (7), 2385-2395 (2010).
- Tai, L. M., Holloway, K. A., Male, D. K., Loughlin, A. J., Romero, I. A. Amyloid-beta-induced occludin down-regulation and increased permeability in human brain endothelial cells is mediated by MAPK activation. J Cell Mol Med. 14 (5), 1101-1112 (2010).
- Tai, L. M., Loughlin, A. J., Male, D. K., Romero, I. A. P-glycoprotein and breast cancer resistance protein restrict apical-to-basolateral permeability of human brain endothelium to amyloid-beta. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1079-1083 (2009).
- Tai, L. M., et al. Polarized P-glycoprotein expression by the immortalised human brain endothelial cell line, hCMEC/D3, restricts apical-to-basolateral permeability to rhodamine 123. Brain Res. 1292, 14-24 (2009).
- Koster, K. P., Thomas, R., Morris, A. W., Tai, L. M. Epidermal growth factor prevents oligomeric amyloid-beta induced angiogenesis deficits in vitro. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1865-1871 (2016).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16 (2013).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
- Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. Isolation and culture of primary mouse brain endothelial cells. Methods Mol Biol. 1135, 345-356 (2014).
- Dahlgren, K. N., et al. Oligomeric and fibrillar species of amyloid-beta peptides differentially affect neuronal viability. J Biol Chem. 277 (35), 32046-32053 (2002).
- Carpentier, G. Angiogenesis Analyzer. ImageJ News. , (2012).
- Thomas, R., et al. Epidermal growth factor prevents APOE4 and amyloid-beta-induced cognitive and cerebrovascular deficits in female mice. Acta Neuropathol Commun. 4 (1), 111 (2016).
- Tai, L. M., et al. The role of APOE in cerebrovascular dysfunction. Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).
- Ambrose, C. T. Neuroangiogenesis: a vascular basis for Alzheimer’s disease and cognitive decline during aging. J Alzheimers Dis. 32 (3), 773-788 (2012).
- Ambrose, C. T. A therapeutic approach for senile dementias: neuroangiogenesis. J Alzheimers Dis. 43 (1), 1-17 (2015).
- Ambrose, C. T. The Role of Capillaries in the Lesser Ailments of Old Age and in Alzheimer’s Disease and Vascular Dementia: The Potential of Pro-Therapeutic Angiogenesis. J Alzheimers Dis. 54 (1), 31-43 (2016).
