JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Automatische Übersetzung
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurowissenschaften

Meten van Synaptic vesikel endocytose in gekweekte Hippocampal neuronen

Published: September 04, 2017
doi:
10.3791/55862
, ,
1National Institute of Neurological Disorders and Stroke, 2College of Pharmacy,Chung-ang University

Summary

Synaptic vesikel endocytose is gedetecteerd door de lichte microscopie van pHluorin gefuseerd met synaptic vesikel eiwit en elektronenmicroscopie van vesikel opname.

Abstract

Tijdens endocytose, worden gesmolten synaptische vesikels opgehaald bij zenuw terminals, waardoor voor vesikel recycling en dus het onderhoud van synaptische transmissie tijdens herhaalde zenuw afvuren. Verminderde endocytose in pathologische omstandigheden leidt tot afname van de synaptische sterkte en hersenen functies. Hier beschrijven we methoden voor het meten van synaptic vesikel endocytose in de synaps zoogdieren hippocampal in neuronale cultuur. We synaptic vesikel eiwit endocytose gecontroleerd door het smelten van een synaptic vesiculaire membraan eiwit, inclusief synaptophysin en VAMP2/synaptobrevin, de vesiculaire lumenal kant, met pHluorin, een pH-gevoelige groen fluorescent proteïne dat verhoogt haar de intensiteit van de fluorescentie aangezien de pH stijgt. Tijdens exocytose, vesiculaire lumen pH verhoogt, terwijl tijdens endocytose vesiculaire lumen pH opnieuw aangezuurde is. Dus geeft een stijging van pHluorin fluorescentie intensiteit fusion, overwegende dat een daling endocytose van het gelabelde synaptic vesikel-eiwit blijkt. Naast het gebruik van de beeldvorming methode pHluorin opnemen endocytose, gecontroleerd we vesiculaire membraan endocytose door elektronenmicroscopie (EM) metingen van Horseradish peroxidase (HRP) opname door blaasjes. Tot slot, wij gecontroleerd de vorming van zenuw terminal membraan kuilen op verschillende tijdstippen na hoog kalium-geïnduceerde depolarisatie. Het tijdsverloop van de vorming van HRP opname en membraan pit geeft aan het tijdsverloop van endocytose.

Introduction

Neurotransmitters zijn opgeslagen in synaptische vesikels en uitgebracht door exocytose. De synaptische vesikel membraan eiwit zijn geïnternaliseerd door endocytose en hergebruikt in de volgende ronde van exocytose. Endocytose van synaptische vesikels is belangrijk voor het behoud van synaptic vesikel zwembaden en uitstekende blaasjes verwijdert uit het plasma-membraan. De pH-gevoelige groen fluorescent proteïne pHluorin, die is uitgeblust in zure omstandigheden en dequenched in neutrale pH, is gebruikt om endocytose tijd cursussen in cellen1,2,3 levendete meten. Het pHluorin eiwit is meestal gekoppeld aan de lumenal kant van synaptic vesikel eiwitten, zoals synaptophysin of VAMP2/synaptobrevin. In rust, is de pHluorin in de 5,5 pH lumen van synaptische vesikels uitgeblust. Vesikel fusie aan het plasma-membraan blootstelt de vesiculaire lumen aan de extracellulaire oplossing waar de pH ~ 7.3 is, resulterend in een stijging in pHluorin fluorescentie. Na exocytose vervalt de verhoogde fluorescentie, als gevolg van endocytose van synaptic vesikel eiwitten gevolgd door vesikel opnieuw verzuring binnen deze herstelde blaasjes. Hoewel het verval zowel endocytose en vesiculaire opnieuw verzuring weerspiegelt, hierin meestal endocytose, omdat opnieuw verzuring sneller dan endocytose in de meeste omstandigheden1,4 is. De tijdconstante van opnieuw verzuring is 3-4-s of minder5,6, dat over het algemeen sneller dan de 10 is s of meer vereist voor vesikel endocytose4,5. Als experimenten nodig zijn voor het onderscheiden van endocytose van opnieuw verzuring, kunnen zuur blussen experimenten met behulp van de 4-Morpholineethanesulfonic (MES) zuuroplossing (25 mM) met een pH van 5.5 worden gebruikt om te bepalen of synaptic vesikel eiwitten worden opgehaald uit het plasma-membraan via endocytose1,3,4. Dus, de verhoging van de intensiteit van de fluorescentie van pHluorin weerspiegelt een balans van exo- en endocytose en de daling na zenuwstimulatie specifiek weerspiegelt endocytose.

pHluorin imaging mogen worden gebruikt niet alleen voor het meten van het tijdsverloop van endocytose, maar ook de grootte van synaptic vesikel zwembaden7,8, en de waarschijnlijkheid van evoked introductie en spontane release9. Vele factoren en eiwitten die betrokken zijn bij het reguleren van endocytose, zoals calcium, oplosbare NSF-gehechtheid eiwit receptor (SNARE) eiwitten, hersenen-afgeleide neurotrophic factor(BDNF) en calcineurin zijn geïdentificeerd met behulp van pHluorin imaging1 , 2 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16. Bovendien, vrijlating van de neurotransmitter in niet alleen primaire neuronen maar in cellen van het neuroblastoom met TIRFM17kon worden opgespoord. Onlangs, pHluorin varianten, dsRed, mOrange en pHTomato werden ontwikkeld voor monitoring van gelijktijdige opnamen van meerdere factoren in een enkele synapse18,19. Bijvoorbeeld, is pHTomato gefuseerd met synaptophysin en gebruikt met een genetisch gecodeerde calcium indicator (GCaMP5K) voor het bewaken van de presynaptische vesikel fusion en Ca2 + toestroom in de postsynaptisch compartiment20. Daarom, pHluorin gekoppeld aan synaptic eiwitten biedt een handige methode voor het analyseren van de relatie tussen endocytose en exocytose.

EM is een andere methode gebruikt bij het bestuderen van endocytose, als gevolg van de hoge ruimtelijke resolutie waarin ultrastructurele wijzigingen tijdens endocytose. Twee algemene gebieden zijn de capaciteit om te visualiseren pathologische veranderingen binnen de neuronale cellen21 en bijhouden van vesikel eiwitten22. In het bijzonder, de waarneming van synaptic vesikel opname, membraan kromming bekleed door clathrin in de periactive zone en endosomal structuren zijn mogelijk met EM3,23,24,25 ,26,27,28. Terwijl EM potentiële artefacten, zoals fixeer-geïnduceerde misvormingen impliceert, die van invloed kunnen zijn op de endocytose en data-analyse is arbeidsintensief, dat de resolutie biedt een aantrekkelijke mogelijkheid om te visualiseren van cellulaire structuur. Potentiële kleefpoeders problemen en de beperking in EM temporele resolutie kunnen worden overwonnen door de hoge druk bevriezing, het verstrekken van een snelle en niet-chemische methode voor het stabiliseren van de delicate structuren aanwezig tijdens endocytose27.

Protocol

Opmerking: het volgende protocol beschrijft de pHluorin imaging en EM methoden gebruikt bij gekweekte hippocampal neuronen. pHluorin monitoren synaptic vesikel eiwit opname in levende cellen en EM detecteert opname van synaptic blaasje en Ultrastructurele wijzigingen. verzorging van de dieren en procedure zijn goedgekeurd door de NIH Animal Care en gebruik Comité NIH richtsnoeren gevolgd. 1. pHluorin Imaging Hippocampal neuron cultuur …

Representative Results

Met behulp van de methode van de vervoerder lipide, is SpH uitgedrukt in de hippocampal neuronen, waardoor voor de identificatie van Los (Figuur 1a). Elektrische stimulatie van de cellen geïnduceerde exocytose en een overeenkomstige stijging van de intensiteit van de fluorescentie. De verhoging van fluorescentie (ΔF) werd gestopt door beëindiging van de stimulus (Figuur 1b). De verhoogde fluorescentie werd gevolgd door een lan…

Discussion

Hier tonen we twee methoden voor de controle van de synaptische vesikel endocytose. In de eerste methode gecontroleerd we pHluorin met een synaptic vesikel eiwit in transfected neuronen gesmolten en vervolgens elektrisch gestimuleerd. Ten tweede hebben we gebruikt EM beeldvorming van HRP opname zoals geïnduceerd door KCl. We gebruikten verschillende prikkels om twee redenen. Ten eerste, toepassing van hoge kalium induceert depolarisatie van alle neuronen in de cultuur. Dit vergemakkelijkt EM onderzoek, gezien het feit d…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij bedanken Dr. Yong-Ling Zhu voor het verstrekken van synaptophysin-pHluorin2x-construct, en Dr. James E. Rothman voor het verstrekken van VAMP2-phluorin. Wij danken Dr. Susan Cheng en Virginia Crocker van NINDS elektronenmicroscopie faciliteit voor hun technische ondersteuning en hulp. Dit werk werd gesteund door de National Institute of Neurological Disorders en beroerte intramurale Research Program in de Verenigde Staten en een subsidie van het KRIBB initiatief onderzoeksprogramma (Korean biomedisch wetenschapper Fellowship Program), Korea Research Institute van Biowetenschappen en biotechnologie, Republiek Korea.

Materials

Lipofectamine LTX with Plus Thermo Fisher 15338-100 Transfection of plasmid DNA including synaptophysin or VAMP2-pHluorin
neurobasal medium Thermo Fisher 21103-049 Growth medium for neuron, Warm up to 37°C before use
B27 Thermo Fisher 17504-044 Gradient for neuronal differentiation
Glutamax Thermo Fisher 35050-061 Gradient for neuronal culture
Poly-D-Lysine coated coverslip Neuvitro GG-25-pdl Substrate for neuronal growth and imaging of pHluorin
Trypsin XI from bovine pancrease Sigma T1005 Neuronal culture-digest hippocampal tissues
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma D5025 Neuronal culture-inhibits viscous cell suspension
pulse stimulator A-M systems model 2100 Apply electrical stimulation
Slotted bath with field stimulation Warner Instruments RC-21BRFS Apply electrical stimulation
stimulus isolation unit Warner Instruments SIU102 Apply electrical stimulation
lubricant Dow corning 111 pHluorin imaging-seal with coverslip and imaging chamber, avoid leak from chamber
AP5 Tocris 3693 Gradient for normal saline, selective NMDA receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity
CNQX Tocris 190 Gradient for normal saline, competitive AMPA/kainate receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity
Illuminator Nikon C-HGFI Metal halide light source for pHluorin
EMCCD camera Andor iXon3 pHluorin imaging, detect pHluorin fluorescence intensity
Inverted microscopy Nikon Ti-E Imaging for synaptophysin or VAMP2 pHluorin transfected cells
NIS-Elements AR Nikon NIS-Elements Advanced Research Software for imaging acquisition and analysis
Igor Pro WaveMetrics Igor pro Software for imaging analysis and data presentation
imaging chamber Warner Instruments RC21B pHluorin imaging, apply field stimulation on living cells
poly-l-lysine Sigma P4832 Electron microscopy, substrate for neuronal growth, apply on multiwell plate for 1 h at room temperature then wash with sterilized water 3 times
Horseradish peroxidase(HRP) Sigma P6782 Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by catalyzing DAB in presence hydrogen peroxide, final concentration is 5 mg/mL in normal saline, make fresh before use
Na cacodylate Electron Microscopy Sciences 12300 Electron microscopy, buffer for fixatives and washing, final concentration is 0.1 N
3,3′-Diaminobenzidine(DAB) Sigma D8001 Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles, substrate for HRP, final concentration is 0.5 mg/mL in DDW and filtered, make fresh before use
Hydrogen peroxide solution Sigma H1009 Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by inducing HRP-DAB reaction, final concentration is 0.3% in DDW, make fresh before use
glutaraldehyde Electron Microscopy Sciences 16365 Electron microscopy, fixatives, final concentration is 4% in Na-cacodylate buffer, make fresh before use, shake well before to use
TEM JEOL 200CX Electron microscopy, imaging of endocytosed vesicles and ultrastructural changes
CCD digital camera AMT XR-100 Electron microscopy, capturing images
Lead citrate Leica microsystems 16707235 Electron microscopy, grid staining
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system. Nature cell biol. 2 (4), 197-204 (2000).
  2. Sun, T., Wu, X. S., et al. The role of calcium/calmodulin-activated calcineurin in rapid and slow endocytosis at central synapses. J Neurosci. 30 (35), 11838-11847 (2010).
  3. Wu, X. -. S. S., Lee, S. H., et al. Actin Is Crucial for All Kinetically Distinguishable Forms of Endocytosis at Synapses. Neuron. 92 (5), 1020-1035 (2016).
  4. Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses. Neuron. 51 (6), 773-786 (2006).
  5. Atluri, P. P., Ryan, T. A. The kinetics of synaptic vesicle reacidification at hippocampal nerve terminals. J Neurosci. 26 (8), 2313-2320 (2006).
  6. Royle, S. J., Granseth, B., Odermatt, B., Derevier, A., Lagnado, L. Imaging phluorin-based probes at hippocampal synapses. Methods Mol Biol. 457, 293-303 (2008).
  7. Moulder, K. L., Mennerick, S. Reluctant vesicles contribute to the total readily releasable pool in glutamatergic hippocampal neurons. J Neurosci. 25 (15), 3842-3850 (2005).
  8. Li, Z., Burrone, J., Tyler, W. J., Hartman, K. N., Albeanu, D. F., Murthy, V. N. Synaptic vesicle recycling studied in transgenic mice expressing synaptopHluorin. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (17), 6131-6136 (2005).
  9. Morris, R. G. Elements of a neurobiological theory of hippocampal function: the role of synaptic plasticity, synaptic tagging and schemas. Eur J Neurosci. 23 (11), 2829-2846 (2006).
  10. Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Calcium accelerates endocytosis of vSNAREs at hippocampal synapses. Nat Neurosci. 4 (2), 129-136 (2001).
  11. Balaji, J., Armbruster, M., Ryan, T. A. Calcium control of endocytic capacity at a CNS synapse. J Neurosci. 28 (26), 6742-6749 (2008).
  12. Ferguson, S. M., Brasnjo, G., et al. A selective activity-dependent requirement for dynamin 1 in synaptic vesicle endocytosis. Science. 316 (5824), 570-574 (2007).
  13. Baydyuk, M., Wu, X. S., He, L., Wu, L. G. Brain-derived neurotrophic factor inhibits calcium channel activation, exocytosis, and endocytosis at a central nerve terminal. J Neurosci. 35 (11), 4676-4682 (2015).
  14. Wu, X. S., Zhang, Z., Zhao, W. D., Wang, D., Luo, F., Wu, L. G. Calcineurin is universally involved in vesicle endocytosis at neuronal and nonneuronal secretory cells. Cell Rep. 7 (4), 982-988 (2014).
  15. Zhang, Z., Wang, D., et al. The SNARE proteins SNAP25 and synaptobrevin are involved in endocytosis at hippocampal synapses. J Neurosci. 33 (21), 9169-9175 (2013).
  16. Wu, L. -. G. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -. C. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annu Rev Physiol. 76 (1), 301-331 (2014).
  17. Daniele, F., Di Cairano, E. S., Moretti, S., Piccoli, G., Perego, C. TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to evaluate neurotransmitter vesicle dynamics in SH-SY5Y neuroblastoma cells: cell imaging and data analysis. J Vis Exp. (95), e52267 (2015).
  18. Shaner, N. C., Lin, M. Z., et al. Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nat Methods. 5 (6), 545-551 (2008).
  19. Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat Neurosci. 15 (7), 1047-1053 (2012).
  20. Leitz, J., Kavalali, E. T. Fast retrieval and autonomous regulation of single spontaneously recycling synaptic vesicles. Elife. 3, e03658 (2014).
  21. Bisht, K., El Hajj, H., Savage, J. C., Sánchez, M. G., Tremblay, M. -. &. #. 2. 0. 0. ;. Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with β-Amyloid Plaques. J Vis Exp. (112), e54060 (2016).
  22. Schikorski, T. Monitoring Synaptic Vesicle Protein Sorting with Enhanced Horseradish Peroxidase in the Electron Microscope. High-Resolution Imaging of Cellular Proteins: Methods and Protocols. , 327-341 (2016).
  23. Kononenko, N. L., Puchkov, D., et al. Clathrin/AP-2 mediate synaptic vesicle reformation from endosome-like vacuoles but are not essential for membrane retrieval at central synapses. Neuron. 82 (5), 981-988 (2014).
  24. Wu, Y., O’Toole, E. T., et al. A dynamin 1-, dynamin 3- and clathrin-independent pathway of synaptic vesicle recycling mediated by bulk endocytosis. eLife. 2014 (3), e01621 (2014).
  25. Heuser, J. E., Reese, T. S. Evidence for recycling of synaptic vesicle membrane during transmitter release at the frog neuromuscular junction. J Cell Biol. 57 (2), 315-344 (1973).
  26. Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. Turnover of transmitter and synaptic vesicles at the frog neuromuscular junction. J Cell Biol. 57 (2), 499-524 (1973).
  27. Watanabe, S., Rost, B. R., et al. Ultrafast endocytosis at mouse hippocampal synapses. Nature. 504 (7479), 242-247 (2013).
  28. Watanabe, S., Trimbuch, T., et al. Clathrin regenerates synaptic vesicles from endosomes. Nature. 515 (7526), 228-233 (2014).
  29. Sankaranarayanan, S., Atluri, P. P., Ryan, T. A. Actin has a molecular scaffolding, not propulsive, role in presynaptic function. Nat Neurosci. 6 (2), 127-135 (2003).
  30. Zhu, Y., Xu, J., Heinemann, S. F. Two pathways of synaptic vesicle retrieval revealed by single-vesicle imaging. Neuron. 61 (3), 397-411 (2009).
  31. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  32. Arnao, M. B. B., Acosta, M., del Rio, J. A. A., García-Cánovas, F. Inactivation of peroxidase by hydrogen peroxide and its protection by a reductant agent. Biochim Biophys Acta. 1038 (1), 85-89 (1990).
  33. Deák, F., Schoch, S., et al. Synaptobrevin is essential for fast synaptic-vesicle endocytosis. Nat Cell Biol. 6 (11), 1102-1108 (2004).
  34. Clayton, E. L., Evans, G. J. O., Cousin, M. A. Bulk synaptic vesicle endocytosis is rapidly triggered during strong stimulation. J Neurosci. 28 (26), 6627-6632 (2008).
  35. Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. Visualizing presynaptic function. Nat Neurosci. 17 (1), 10-16 (2014).
  36. Wienisch, M., Klingauf, J. Vesicular proteins exocytosed and subsequently retrieved by compensatory endocytosis are nonidentical. Nat Neurosci. 9 (8), 1019-1027 (2006).
  37. Fernández-Alfonso, T., Kwan, R., Ryan, T. A. Synaptic vesicles interchange their membrane proteins with a large surface reservoir during recycling. Neuron. 51 (2), 179-186 (2006).
  38. Gimber, N., Tadeus, G., Maritzen, T., Schmoranzer, J., Haucke, V. Diffusional spread and confinement of newly exocytosed synaptic vesicle proteins. Nat Commun. 6, 8392 (2015).
  39. Nicholson-Fish, J. C., Smillie, K. J., Cousin, M. A. Monitoring activity-dependent bulk endocytosis with the genetically-encoded reporter VAMP4-pHluorin. J Neurosci Methods. 266, 1-10 (2016).
  40. Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin. Nat Protoc. 1 (6), 2970-2978 (2006).
  41. Wisse, E., Braet, F., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World journal of gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
  42. Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing Photodamage in Live-Cell Microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
  43. Søndergaard, C. R., Garrett, A. E., et al. Structural artifacts in protein-ligand X-ray structures: implications for the development of docking scoring functions. J Med Chem. 52 (18), 5673-5684 (2009).

Tags

Synaptic Vesicle EndocytosisHippocampal NeuronsPoly-d-lysineHigh Potassium StimulationGlutaraldehydeSodium Cacodylate BufferDAB SolutionOsmium TetroxideSodium Acetate BufferUranyl AcetateDehydrationElectron Microscopy

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Villarreal, S., Lee, S. H., Wu, L. Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons. J. Vis. Exp. (127), e55862, doi:10.3791/55862 (2017).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image