PIP-on-a-Chip: Eine Label-freie Studie von Protein-Phosphoinositid-Wechselwirkungen

Summary

Hier präsentieren wir eine unterstützte Lipiddoppelschicht im Rahmen einer mikrofluidischen Plattform zur Untersuchung von Protein-Phosphoinositid-Wechselwirkungen unter Verwendung eines etikettfreien Verfahrens auf Basis der pH-Modulation.

Abstract

Zahlreiche zelluläre Proteine ​​wechselwirken mit Membranoberflächen, um essentielle zelluläre Prozesse zu beeinflussen. Diese Wechselwirkungen können auf eine spezifische Lipidkomponente innerhalb einer Membran gerichtet sein, wie im Fall von Phosphoinositiden (PIPs), um eine spezifische subzelluläre Lokalisation und / oder Aktivierung zu gewährleisten. PIPs und zelluläre PIP-bindende Domänen wurden intensiv untersucht, um ihre Rolle in der zellulären Physiologie besser zu verstehen. Wir haben einen pH-Modulationstest auf geträgerten Lipiddoppelschichten (SLBs) als ein Werkzeug zur Untersuchung von Protein-PIP-Wechselwirkungen angewendet. In diesen Studien wird pH-sensitives ortho- Sulforhodamin B-konjugiertes Phosphatidylethanolamin verwendet, um Protein-PIP-Wechselwirkungen zu detektieren. Nach der Bindung eines Proteins an eine PIP-haltige Membranoberfläche wird das Grenzflächenpotential moduliert ( dh Änderung des lokalen pH-Werts), wobei der Protonierungszustand der Sonde verschoben wird. Eine Fallstudie der erfolgreichen Verwendung des pH-Modulationstests wird unter Verwendung von Phospholipase C delta1 PleckstrIn der Homologie (PLC-δ1 PH) -Domäne und Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PI (4,5) P ₂ ) -Interaktion als Beispiel. Die scheinbare Dissoziationskonstante ( _{Kd, app} ) für diese Wechselwirkung betrug 0,39 ± 0,05 μM, ähnlich _{Kd, app-} Werte, die von anderen erhalten wurden. Wie bereits erwähnt, ist die PLC-δ1-PH-Domäne PI (4,5) P ₂ spezifisch, zeigt eine schwächere Bindung an Phosphatidylinositol-4-phosphat und keine Bindung an reine Phosphatidylcholin-SLBs. Der PIP-on-a-Chip-Assay ist gegenüber herkömmlichen PIP-Bindungsassays vorteilhaft, einschließlich, aber nicht beschränkt auf niedrige Probenvolumina und keine Ligand / Rezeptor-Markierungsanforderungen, die Fähigkeit, hoch- und niederaffine Membran-Wechselwirkungen sowohl mit kleinen als auch mit testen zu testen Große Moleküle und ein verbessertes Signal-Rausch-Verhältnis. Dementsprechend wird die Verwendung des PIP-on-a-Chip-Ansatzes die Aufklärung von Mechanismen einer breiten Palette von Membranwechselwirkungen erleichtern. Darüber hinaus könnte diese Methode möglicherweise u seinSed bei der Identifizierung von Therapeutika, die die Fähigkeit des Proteins modulieren, mit Membranen zu interagieren.

Introduction

Unzählige Wechselwirkungen und biochemische Prozesse finden auf zweidimensional flüssigen Membranoberflächen statt. Membran-umschlossene Organellen in eukaryotischen Zellen sind nicht nur in biochemischen Prozessen und ihrem assoziierten Proteom, sondern auch in ihrer Lipidzusammensetzung einzigartig. Eine außergewöhnliche Klasse von Phospholipiden ist Phosphoinositide (PIPs). Obwohl sie nur 1% des zellulären Lipidoms enthalten, spielen sie eine entscheidende Rolle bei der Signaltransduktion, Autophagie und Membranhandel unter anderem ^{1 , 2 , 3 ,}

Protocol

1. Reinigung der Glasdeckel

1. 7x Reinigungslösung verdünnen (siehe Werkstofftabelle ) 7-fach mit entionisiertem Wasser in einer 100 mm tiefen Borsilikatglasschale mit flachem Boden und erhitze sie bis zu 95 ° C auf einer ebenen Heizplatte für 20 min oder bis die trübe Lösung klar wird .
   HINWEIS: Die Lösung wird heiß, Vorsicht, um Körperverletzungen zu vermeiden. Die 7x Reinigungslösung ist eine proprietäre Mischung aus Hexanatrium [oxido- [oxido (phosphonatooxy) phosphoryl] oxyphosphoryl] phosphat, 2- (2-Butoxyethoxy) ethanol, Natrium-1,4-bis (2-ethylhexoxy) -1,4-dioxobutan -2-sulfonat und nicht gefährliche Zusätze.
2. Mit Pinzet....

Results

Wir verwendeten den pH-Modulationstest, um die PLC-δ1 PH-Domäne-PI (4,5) P ₂ -Interaktion innerhalb eines PIP-on-a-Chip-Mikrodevals zu untersuchen ( Abbildung 1 ). Durch ein detailliertes Protokoll haben wir gezeigt, wie man mikrofluidische Gerätekomponenten vorbereitet und zusammensetzt, kleine unilamellare Vesikel (SUVs) bildet ( Abbildung 2 ), SLBs innerhalb einer Vorrichtung bilden ( Abbildung.......

Discussion

Jede PIP-Variante, wenn auch bei niedrigen Konzentrationen, liegt auf der zytosolischen Oberfläche spezifischer Organellen vor, wo sie zur Etablierung einer einzigartigen physikalischen Zusammensetzung und funktionellen Spezifität der organellaren Membran ¹ beitragen. Eine der wichtigsten Verwendungen von PIPs ist eine spezifische Docking-Plattform für die Vielzahl von Proteinen, die eine spezifische subzelluläre Lokalisierung und / oder Aktivierung erfordern ^{6 ,}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Deckglas
Deckgläser: Rechtecke	Fisher Scientific	12-544B	22 x 40 x 0,16 - 0,19 mm, Nr. 1 1/2; Borosilikatglas
7X Reinigungslösung	MP Biomedicals	976670	Reinigungsmittel
PYREX Kristallisationsschale	Corning	3140-190	Borosilikatglasschale mit flachem Boden; Durchmesser x Höhe (190 x 100 mm); Händler: VWR (89090-700)
Sentry Xpress 2.0	Paragon Industries	SC-2	Kiln
Name	Company	Katalognummer	>
>
Sylgard 184 Silikonelastomer Kit	Dow Corning	4019862	Polydimethylsiloxan (PDMS); Vertrieb: Ellsworth Adhesives
PYREX Exsikkator	VWR	89134-402
Vakuumbewerteter Biopsiestempel	Harris	15110-10	Harris Uni-Core; 1,0 mm Durchmesser; Miltex Biopsie-Stanze mit Kolben (Kat. Nr. 15110-10) kann alternativ verwendet werden
Name	Company	Katalognummer<	>Kommentare
Gerät
Plasma-Reinigungssystem	PlasmaEtch	PE25-JW	2-stufige Öl-Vakuumpumpe mit Direktantrieb, O2-Service (Krytox aufgeladen)
Digitale Heizplatte	Benchmark	H3760-H	Erworben über Denville Scientific (Kat. Nr. 1005640)
Fixierte Mikro-Dias	VWR	48312-003	mattiert, selektiert und vorgereinigt; Hergestellt aus Schweizer Glas; Dicke: 1 mm; Abmessungen: 75 x 25 mm; GR 144
Name	Unternehmen	Katalognummer<	strong>Kommentare
Mold
AutoCAD	Autodesk	v.2016	Zeichensoftware für das Fotomaskendesign
Photomask	CAD/Art Services	N/A	Das Design mit schwarzem Hintergrund und klaren Merkmalen wurde mit einer Auflösung von 20k dpi auf eine transparente Maske (5 x 7 Zoll) gedruckt von CAD/Art Services
Silikonwafer	Universitätswafer	1575	Prime Grade, einseitig poliert; 100 mm (4 Zoll) Durchmesser; 525 μm Dicke
SU-8 50	MicroChem Corp.	N/A	Negativton-Fotolack; Penn State Nanofabrication Facility Grundstück
SU-8 Entwickler	MicroChem Corp.	N/A	Penn State Nanofabrication Facility Property
Name	Company	Katalognummer	Kommentare
SUV
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin	Avanti Polare Lipide	850457C	POPC
L-α-phosphatidylinositol-4-phosphat	Avanti Polare Lipide	840045X	PI4P
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat	Avanti Polare Lipide	840046X	PI(4,5)P2
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin	Avanti Polare Lipide	850757C	POPE; Erforderlich für die Synthese von oSRB-POPE
Lissamin, Rhodamin, B-Sulfonylchlorid (gemischte Isomere)	ThermoFisher Scientific	L-20	Erforderlich für die Synthese von oSRB-POPE pH-empfindlicher
fluoreszierender Lipidsonde (oSRB-POPE)	Inhouse:	N/A	, Inhouse-Synthese (Huang, D. et al., 2013)
Glasszintillationsfläschchen	VWR	66022-065	20 mL Volumenkapazität
Aquasonic 250D	VWR	N/A
Membranen	Whatman	110605	Polycarbonat-Membran; Durchmesser: 25 mm; Porengröße: 0,1 μm; Vertrieb: Sigma-Aldrich
Chloroform	VWR	CX1054-6	HPLC
Grade LIPEX Extruder	Transferra Nanosciences	T.001	LIPEX 10 mL Thermobarrel
Extruder Viscotek 802 DLS	Malvern Instruments	N/A	Dynamische Lichtstreuung; Penn State X-Ray Crystallography Facility Property
Name	<>Company	Katalognummer	Comments
Data Analysis
GraphPad Prism	GraphPad Software	v.6	Kurvenanpassungssoftware für die Datenanalyse
Name	<>Unternehmen	<>Katalognummer	Kommentare
Mikroskop
Axiovert 200M Epifluoreszenzmikroskop	Carl Zeiss Mikroskopie	N/A	Mikroskop
AxioCam MRm Kamera	Carl Zeiss Mikroskopie	N/A	Kamera
X-Cite 120	Excelitas Technologies	N/A	Lichtquelle
Alexa 568 Filterset	Carl Zeiss Mikroskopie	N/A	Ex/Em 576/603 nm
AxioVision LE64 v.4.9.1.0 Software	Carl Zeiss Mikroskopie	N/A	Bildverarbeitungssoftware
Name	Company	Katalognummer	Kommentare
Andere
			; Dünne und glatte Spitze zum Auftragen der Proteinlösung in den mikrofluidischen Kanal
Tipps	VWR	53509-070	10 μl Pipettenspitzen; Dünne und glatte Spitze zum Auftragen der Vesikellösung in den mikrofluidischen Kanal
Orion Star A321 pH-Messgerät	Thermo Scientific	STARA3210 pH-Messgerät
Orion Mikro-pH-Sonde	Thermo Scientific	8220BNWP	Mikro-pH-Sonde
N-(2-Hydroxyethyl)-Piperazin-N'-(2-Ethansulfonsäure)	VWR	VWRB30487	HEPES, Freie Säure
Natriumchlorid	VWR	BDH8014-2.5KGR	NaCl-Schläuche
	Allied Wire & Kabel	TFT-200-24 N	Innendurchmesser: 0,020-0,026 Zoll (0,051-0,066 cm); Wandstärke: 0,025 cm (0,010 Zoll); Flexible dünnwandige Schläuche aus Polytetrafluorethylen; Natürliche Farbe
Stickstoff Gas - Industrie	Praxair	N/A	Lokaler Anbieter
Sauerstoff Gas - Industrie	Praxair	N /A	Lokaler Anbieter
Flüssiger Stickstoff	Praxair	N/A	Lokaler Anbieter