Qui presentiamo un bilingue lipidico supportato nel contesto di una piattaforma microfluidica per studiare le interazioni proteine-fosfoinositide usando un metodo senza etichetta basato sulla modulazione del pH.
Numerose proteine cellulari interagiscono con superfici di membrana per influenzare processi cellulari essenziali. Queste interazioni possono essere indirizzate verso una componente lipidica specifica all'interno di una membrana, come nel caso di fosfoinositide (PIP), per garantire una localizzazione e / o un'attivazione subcellulare specifica. PIPs e domini cellulari PIP-binding sono stati studiati in modo estensivo per comprendere meglio il loro ruolo nella fisiologia cellulare. Abbiamo applicato un saggio di modulazione del pH sui bilayers lipidici supportati (SLBs) come uno strumento per studiare le interazioni proteine-PIP. In questi studi è stata utilizzata la fosfatidiletiletilammina coniugata con orto- Solforodina B sensibile al pH per rilevare interazioni proteine-PIP. Dopo il legame di una proteina a una superficie di membrana contenente PIP, il potenziale di interfaccia è modulato ( cioè il cambiamento nel pH locale), spostando lo stato di protonazione della sonda. Un caso di studio sull'uso efficace del saggio di modulazione del pH è presentato utilizzando fosfolipasi C delta1 PleckstrIn omologia (PLC-δ1 PH) e fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato (PI (4,5) P 2 ) come esempio. L'apparente costante di dissociazione ( K d, app ) per questa interazione era 0,39 ± 0,05 μM, simile a K d, valori app ottenuti da altri. Come osservato in precedenza, il dominio del PLC-δ1 è PI (4,5) P 2 specifico, mostra un legame più debole verso fosfatidilinositolo 4-fosfato, e nessun legame con SLB di fosfatidilcolina pura. Il test PIP-on-a-chip è vantaggioso rispetto ai test tradizionali PIP-binding, tra cui, ma non limitati, il basso numero di campioni e nessun requisito di etichettatura del ligando / del recettore, la capacità di testare interazioni a membrane di alta e bassa affinità con piccole e Grandi molecole e un miglior rapporto segnale / rumore. Di conseguenza, l'utilizzo del metodo PIP-on-a-chip faciliterà la chiarificazione dei meccanismi di una vasta gamma di interazioni di membrana. Inoltre, questo metodo poteva essere uNel identificare le terapie che modulano la capacità della proteina di interagire con le membrane.
Interazioni di microrganismi e processi biochimici avvengono su superfici a membrana bidimensionale fluida. Gli organelli racchiusi in membrana in cellule eucariotiche sono uniche non solo nei processi biochimici e nel loro proteome associato, ma anche nella loro composizione lipidica. Una classe eccezionale di fosfolipidi è fosfoinositide (PIP). Anche se comprendono solo l'1% del lipidome cellulare, essi svolgono un ruolo cruciale nella trasduzione del segnale, nell'autofagia e nel traffico di membrana tra gli altri 1 , 2 , 3 , 4 . La fosforilazione dinamica del gruppo testa inositolo per le cellule PIP chinasi dà origine a sette gruppi di capi PIP che sono mono-, bis-, o tris-fosforilati 5 . Inoltre, i PIP definiscono l'identità subcellulare delle membrane e servono come siti di ancoraggio a membrana specializzati per proteine / enzimi che contengono uno o più fosfoidiDomini leganti, ad esempio Homology Pleckstrin (PH), Phox Homology (PX) e Epsin N-terminal Homology (ENTH) 6 , 7 . Uno dei domini PIP-legame più studiati è fosfolipasi C (PLC) dominio PH -δ1 che interagisce specificamente con fosfatidilinositolo 4,5-bifosfato (PI (4,5) P 2) all'interno di un alto nanomolari-gamma bassa affinità micromolare 8 , 9 , 10 , 11 .
Sono stati sviluppati diversi metodi qualitativi e quantitativi in vitro e utilizzati per studiare il meccanismo, la termodinamica e la specificità di queste interazioni. Tra i più comuni metodi di rilascio PIP sono la risonanza plasmonica superficiale (SPR), la calorimetria isotermica (ITC), la spettroscopia magnetica nucleare (NMR), il test di flottazione / sedimentazione dei liposomi e le macchie lipidiche (grasso-blots / PIP-strips)12 , 13 . Anche se questi sono ampiamente utilizzati, tutti hanno molti svantaggi. Ad esempio, SPR, ITC e NMR richiedono grandi quantità di campioni, strumentazione costosa e / o personale addestrato 12 , 13 . Alcuni formati di analisi come i blot di lipidi a base di anticorpi utilizzano forme solubili in acqua di PIP e li presentano in modo non fisiologico 12 , 14 , 15 , 16 . Inoltre, le macchie lipidiche non possono essere quantificate in modo affidabile e spesso hanno portato a osservazioni false positivo / negativo 12 , 17 , 18 . Per superare queste sfide e migliorare l'attuale set di strumenti, è stato stabilito un nuovo metodo senza etichetta basato su un duplicato lipidico supportato (SLB) nel contesto di Piattaforma microfluidica, che è stata applicata con successo allo studio delle interazioni proteine-PIP ( Figura 1 ) 19 .
La strategia utilizzata per rilevare le interazioni proteine-PIP è basata sulla sensazione di modulazione del pH. Ciò comporta una tintura sensibile al pH che ha orto- solforodamina B ( o SRB) direttamente coniugata al gruppo tossico lipidico della fosfatidiletanolammina 20 . La sonda o SRB-PAPA (Figura 2A) è altamente fluorescente a pH basso e spenta a pH elevato con un pKa circa 6,7 entro 7,5 moli% PI (4,5) P 2 SLB -aventi (Figura 5B). Il dominio PH del PLC-δ1 è stato ampiamente utilizzato per la convalida delle metodologie di legame di proteine-PIP a causa della sua elevata specificità nei confronti di PI (4,5) P 2 ( Figura 5A ) 21 , 22 ,"> 23 , 24 , 25. Quindi, abbiamo ragionato che il dominio PL PLC-δ1 possa essere utilizzato per testare il suo legame a PI (4,5) P 2 attraverso il test PIP-on-a-chip. Utilizzata in questo studio ha una carica netta positiva (pI 8.4) e attrae quindi gli OH – ioni ( Figura 5C ). Quando si lega a SLB che contengono PI (4,5) P 2 , il dominio PH porta gli OH – ioni al La superficie della membrana, che a sua volta modula il potenziale di interfaccia e sposta lo stato di protonazione di o SRB-POPE ( Figura 5C ) 26. In funzione della concentrazione del dominio di PH, la fluorescenza viene fatta abbrutire ( Figura 6A ). Adatta ad un'isoterma legante per determinare l'affinità dell'interazione di PH-dominio-PI (4,5) P 2 ( Figura 6B , 6C ). </ P>
In questo studio viene fornito un protocollo dettagliato per eseguire la legame delle proteine a SLB contenenti PIP all'interno di una piattaforma microfluidica. Questo protocollo prende il lettore dall'assemblaggio del dispositivo microfluidico e della preparazione della vescicola alla formazione di SLB e alla legatura delle proteine. Inoltre sono fornite indicazioni per l'analisi dei dati per estrarre le informazioni di affinità per l'interazione PLC-δ1 PH-dominio-PI (4,5) P 2 .
Ogni variante PIP, seppure a basse concentrazioni, è presente sulla superficie citosolica di organismi specifici in cui contribuiscono alla creazione di una composizione fisica e specificità funzionale della membrana organellare 1 . Uno degli usi più importanti di PIPs è come una piattaforma specifica di docking per la moltitudine di proteine che richiedono localizzazione e / o attivazione subcellulare specifica 6 , 7 . A causa …
The authors have nothing to disclose.
DS e CEC sono stati sostenuti, in parte, dalla sovvenzione AI053531 (NIAID, NIH); SS e PSC sono stati sostenuti dalla sovvenzione N00014-14-1-0792 (ONR).
Coverslip | |||
Glass Coverslips: Rectangles | Fisher Scientific | 12-544B | 22 x 40 x 0.16 – 0.19 mm, No. 1 1/2; Borosilicate Glass |
7X Cleaning Solution | MP Biomedicals | 976670 | Detergent |
PYREX Crystallizing Dish | Corning | 3140-190 | Borosilicate glass dish with a flat bottom; Diameter x Height (190 x 100 mm); Distributor: VWR (89090-700) |
Sentry Xpress 2.0 | Paragon Industries | SC-2 | Kiln |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
PDMS | |||
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 4019862 | Polydimethylsiloxane (PDMS); Distributor: Ellsworth Adhesives |
PYREX Desiccator | VWR | 89134-402 | Vacuum Rated |
Biopsy punch | Harris | 15110-10 | Harris Uni-Core; 1.0 mm diameter; Miltex Biopsy Punch with Plunger (Cat. No. 15110-10) can be used as an alternative |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Device | |||
Plasma Cleaning System | PlasmaEtch | PE25-JW | 2-stage Direct Drive Oil Vacuum Pump, O2 service (Krytox Charged) |
Digital Hot Plate | Benchmark | H3760-H | Purchased through Denville Scientific (Cat. No. 1005640) |
Frosted Micro Slides | VWR | 48312-003 | Frosted, Selected, and Precleaned; Made of Swiss Glass; Thickness: 1 mm; Dimensions: 75 x 25 mm; GR 144 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Mold | |||
AutoCAD | Autodesk | v.2016 | Drafting software for the photomask design |
Photomask | CAD/Art Services | N/A | Design with black background and clear features was printed at 20k dpi resolution on a transparent mask (5 x 7 in) by CAD/Art Services |
Silicone Wafers | University Wafer | 1575 | Prime Grade, Single Side Polished; 100 mm (4 inch) Diameter; 525 um Thickness |
SU-8 50 | MicroChem Corp. | N/A | Negative Tone Photoresist; Penn State Nanofabrication Facility Property |
SU-8 Developer | MicroChem Corp. | N/A | Penn State Nanofabrication Facility Property |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
SUV | |||
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850457C | POPC |
L-α-phosphatidylinositol-4-phosphate | Avanti Polar Lipids | 840045X | PI4P |
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate | Avanti Polar Lipids | 840046X | PI(4,5)P2 |
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850757C | POPE; Required for the synthesis of oSRB-POPE |
Lissamine Rhodamine B Sulfonyl Chloride (mixed isomers) | ThermoFisher Scientific | L-20 | Required for the synthesis of oSRB-POPE |
pH Sensitive Fluorescent Lipid Probe (oSRB-POPE) | In-house | N/A | In-house Synthesis (Huang D. et al. 2013) |
Glass Scintillation Vial | VWR | 66022-065 | 20 mL volume capacity |
Aquasonic 250D | VWR | N/A | Ultrasonic Water Bath |
Nuclepore Track-Etched Membranes | Whatman | 110605 | Polycarbonate Membrane; Diameter: 25 mm; Pore Size: 0.1 um; Distributor: Sigma-Aldrich |
Chloroform | VWR | CX1054-6 | HPLC grade |
LIPEX Extruder | Transferra Nanosciences | T.001 | LIPEX 10 mL Thermobarrel Extruder |
Viscotek 802 DLS | Malvern Instruments | N/A | Dynamic Light Scattering; Penn State X-Ray Crystallography Facility Property |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Data Analysis | |||
GraphPad Prism | GraphPad Software | v.6 | Curve-fitting software for data analysis |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microscope | |||
Axiovert 200M Epifluorescence Microscope | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Microscope |
AxioCam MRm Camera | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Camera |
X-Cite 120 | Excelitas Technologies | N/A | Light Source |
Alexa 568 Filter Set | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Ex/Em 576/603 nm |
AxioVision LE64 v.4.9.1.0 Software | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Image Processing Software |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Andere | |||
Tips | VWR | 10034-132 | 200 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the protein solution into the microfluidic channel |
Tips | VWR | 53509-070 | 10 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the vesicle solution into the microfluidic channel |
Orion Star A321 pH meter | Thermo Scientific | STARA3210 | pH meter |
Orion micro pH probe | Thermo Scientific | 8220BNWP | micro pH probe |
N-(2-Hydroxyethyl)-Piperazine-N'-(2-Ethanesulfonic Acid) | VWR | VWRB30487 | HEPES, Free Acid |
Sodium Chloride | VWR | BDH8014-2.5KGR | NaCl |
Tubing | Allied Wire & Cable | TFT-200-24 N | Internal Diameter: 0.020-0.026 inches (0.051-0.066 cm); Wall Thickness: 0.010 inches (0.025 cm); Flexible Polytetrafluoroethylene Thin-Wall Tubing; Natural Color |
Nitrogen Gas – Industrial | Praxair | N/A | Local Provider |
Oxygen Gas – Industrial | Praxair | N/A | Local Provider |
Liquid Nitrogen | Praxair | N/A | Local Provider |