단백질 단백질 상호 작용 Autophagy 연구에서의 연구
Summary
여기는 두 항 체 기반 단백질-단백질 상호 작용 연구 기법 제시: 면역 형광 및 immunoprecipitation. 이 기술은 물리적 상호작용 단백질 세포질 신호 통로의 소설 구성 요소의 발견 및 이해 단백질 역학 공부 위해 적당 하다.
Abstract
단백질 단백질 상호 작용 이해 셀룰러 신호 폭포 및 식별 소설 통로 구성 요소 단백질 역학 중요 하다. 세포 활동의 대부분 필요 단백질 사이 육체적 인 상호 작용. 분석 하 고 이러한 상호 작용 지도, 다양 한 실험적인 기술 뿐만 아니라 생물 정보학 도구 개발 되었다. Autophagy는 영양 부족, 화학 물질 및 산소를 포함 하 여 다른 스트레스에 대처 하기 위해 셀 수 있도록 메커니즘을 재활용 휴대. Autophagy 관련 신호 이벤트를 더 잘 이해 하 고 단백질 복합물에서 autophagy 조절 하는 새로운 요소를 발견, 우리는 단백질 단백질 상호 작용 화면을 수행. 이러한 심사 결과의 유효성 검사에는 면역 형광 및 immunoprecipitation 기술을 사용을 해야합니다. 이 시스템에서 우리가 발견 특정 autophagy 관련 된 단백질-단백질 상호 작용은 Neuro2A에서 테스트 되었습니다 (N2A) 및 HEK293T 세포 라인. 이 시각된 실험 종이에 사용 되는 기술 절차의 세부 사항 설명 합니다.
Introduction
Macroautophagy (autophagy, 여기) 대량 세포질, 단백질과 autophagic vesicles 라는 이중 막 소포에서 세포의 격리에 의해 특징입니다 세포 스트레스 메커니즘입니다. 이중 막의 외부 층의 융합을 통해 autophagic 소포 및 그들의 화물 리소좀에 배달 되 고 거기에1저하. Autophagy 모든 세포 유형 및 단백질 저하 등 (예, 미토 콘 드리 아) 세포 기관이 회전율 homeostatic 기능을 수행 하는 모든 유기 체에 낮은 기저 수준에서 발생 합니다. 기아, 같은 세포질 긴장에 지도 하는 조건 하에서 autophagy 빠르게 upregulated 이며 기본 대사1,2,3에너지 레벨을 유지 하기 위해 셀 수 있습니다.
누 룩에서 복제 되어 약 30 autophagy 유전자와 단백질 제품 autophagic 과정, 소포 nucleation, 확장, 늦은 endosome/리소좀, 및 화물 저하 기 퓨전 등의 다양 한 단계에서 역할을 표시 했다 4 , 5.이 유전자의 대다수의 Orthologs 확인 되었습니다 및 그들의 세포질 기능6의 보존을 확인 하는 다양 한 유기 체에 연구. 지난 10 년간에서 연구 보여주었다 여러 autophagy 관련 단백질 복합물 및 단백질-단백질 상호 작용 및 그들은 복잡 하 고 제어 방식 autophagy 통로 지배. 교차로, 백업, 피드백, 피드 포워드 메커니즘 존재, 그리고 다른 관련된 이벤트 (예: 기공을 분 비, 리소좀 속, endosomal 정렬 및 전송7, 등)와 autophagy 조정 셀 수 미끼로 autophagy 단백질 ATG5를 사용 하 여 편견된 효 모 2 잡종 스크린에서 (ATG5는 기아에서 LC3 lipidation 중재 e 2와 같은 conjugating 시스템에 관련 된 주요 autophagy 단백질 유도 autophagy), 수용 체 활성화 확인 했습니다 C-키 1 (RACK1; GNB2L1) 강한 interactor 및 소설 autophagy 구성 요소8. 중요 한 것은, 화면이 보였다 ATG5 RACK1 상호 작용 autophagy 클래식 inducers (즉, 기아와 mTOR 억제)에 의해 autophagy 유도 불가결 이었다.
면역 형광 검사 기반 방법 일반적으로 단백질 단백질 상호 작용을 모니터링 하는 데 사용 됩니다. 이 기술은 주로 항 체 기반 하 고 상호 작용을 시각화 하 고 세포질 지 방화를 확인 하는 데 도움이. 이 기술에서는, 형광 태그 활용 된 항 체 관련 된 관심사의 단백질은 일반적으로 특정 얼룩에 사용 됩니다. 각 단백질 다른 형광 성 염료를 결합 하는 항 체와 함께 표시 될 수 있습니다. 단백질-특정 항 체를 사용 하 여 이미지 병합 되 면 신호에 겹치는 confocal 현미경 검사 법에서 단백질의 공동 지역화를 나타냅니다. 기술은 셀 이나 심지어 조직에 적용 됩니다. 면역 형광 검사 기술을 상호 역학에 대 한 단서를 제공 하 고 크기와 다른 조건9에서 세포 형태학에 있는 일반적인 변화를 추적 하는 동안 단백질 복합물의 분포를 식별 하는 데 도움이. Immunoprecipitation는 다른 일반적으로 사용 되 항 체 기반 기술 상호 작용의 분석에 대 한 수 사이 주어진 단백질10. 이 기술을 사용 하 여, 관심사의 단백질 격리 된 셀에서 또는 조직 추출 단백질 복잡 한 또는 관심사의 단백질 접촉의 강 수의 결과로 특정 항 체를 사용 하 여. 공동-immunoprecipitation, 단백질 및 그것의 공동 interactor는 검색 뿐만 아니라 두 개의 단백질 사이 상호 작용을 보여 하지만 다른 상황11에서 상호 작용의 그것의 힘을 측정할 수 있습니다.
이 프로토콜은 확인 하 고 특성을 ATG5-RACK1 및 RACK1 LC3 상호 작용 하는 데 사용 된 세부 핵심 기술에 설명 합니다. 초점은 중요 한 단계 및 함정 autophagy 연구로 해결의 강조와 함께 면역 형광 및 immunoprecipitation 기술에 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immunoprecipitation 및 면역 형광 기법 단백질 단백질 상호 작용의 연구에 대 한 중요 한 있습니다. 이러한 두 가지 기술을 일반적으로 사용 되 고 잘 설립, 비록 몇 가지 기준은 이러한 기법을 사용 하는 동안 실험의 품질을 정의 하 고려 되어야 한다.
이 테스트에서 사용 되는 첫 번째, 1 차 항 체는 관심사의 단백질에 특정 해야 합니다. 을 보장 하기 위해이 테스트에 항 체의 특이?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 과학 및 터키 과학 기술 연구 위원회 (TUBITAK) 1001 그랜트 107T153, Sabanci 대학교에 의해 지원 되었다. 세 브와 NMK 박사 연구 TUBITAK BIDEB 2211 장학금에 의해 지원 됩니다.
Materials
| Trypsin EDTA Solution A | Biological Industries | BI03-050-1A | |
| PBS | GE Healthcare | SH-30256.01 | |
| DMEM (high glucose) | Sigma | 5671 | |
| DMEM (low glucose) | Sigma | 5546 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Hemocytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| coverslides | Jena Bioscience | CSL-103 | |
| slides | Isolab | I.075.02.005 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Torin | Tocris | 4247 | |
| DMSO | Sigma | VWRSAD2650 | |
| EBSS | Biological Industries | BI02-010-1A | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | 15812-7 | |
| BSA | Sigma | A4503 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| LC3 Antibody | Sigma | L7543 | |
| Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11011 | |
| RACK1 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17754 | |
| Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| NP-40 | Applichem | A16694.0250 | |
| Sodium Chloride | Applichem | A9242.5000 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Biochemika | A2572 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Triton-X | Applichem | 4975 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| ATG5 Antibody | Sigma | A0856 | |
| Glycerol | Applichem | A4453 | |
| β-Mercaptoethanol | Applichem | A1108.0250 | |
| Bromophenol blue | Applichem | A3640.0005 | |
| Non-Fat milk | Applichem | A0830 | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Sodium Azide | Riedel de Haen | 13412 | |
| Phenol red | Sigma | 114537-5G | |
| anti-rabbit IgG , HRP conjugated | Jackson Immuno. | 1110305144 | |
| Luminol | Fluka | 9253 | |
| Coumeric Acid | Sigma | C9008 | |
| Hydrogen Peroxide | Merck | K35522500604 | |
| anti mouse IgG, HRP conjugated | Jackson Immuno. | 115035003 | |
| β-Actin Antibody | Sigma | A5441 | |
| Normal rabbit serum | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | |
| Rapamycin | Sigma | R0395 | |
| Protein A-Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2001 | |
| fetal bovine serum | Biowest | S1810-500 | |
| penicillin/streptomycin solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| L-glutamine | Biological Industries | BI03-020-1B | |
| Bradford Solution | Sigma | 6916 | |
| Nitocellulose membrane | GE Healthcare | A10083108 | |
| X-ray Films | Fujifilm | 47410 19289 | |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 |
Referenzen
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