توطين الجينات مستقبلات أودورانت في هوائيات الجراد بواسطة الحمض النووي الريبي<em> في الموقع</em> التهجين
Summary
تصف هذه الورقة رنا مفصلة وفعالة للغاية في بروتوكول التهجين الموضعي وخاصة بالنسبة لمستوى منخفض الجينات مستقبلات رائحة، فضلا عن الجينات الأخرى، في هوائيات الحشرات باستخدام ديجوكسيجينين (ديغ) – الملصقة أو تحقيقات المسمى البيوتين.
Abstract
وقد طورت الحشرات أنظمة استقبال شمية متطورة لتشعر بإشارات كيميائية خارجية. يتم ترانزدوسد هذه الإشارات الكيميائية من قبل الخلايا العصبية مستقبلات الشمية (أورنز) الموجود في هياكل تشبه الشعر، ودعا تشيموسنسيلا، من الهوائيات. على الأغشية أورنس، ويعتقد أن مستقبلات أودورانت (أورس) أن تشارك في ترميز الرائحة. وبالتالي، فإن القدرة على تحديد الجينات المترجمة إلى أورن ضروري للاعتراف أو الجينات، ويوفر أساسا أساسيا لمزيد من الدراسات الوظيفية في الموقع . مستويات التعبير الحمض النووي الريبي من أور أور محددة في هوائيات الحشرات منخفضة جدا، والحفاظ على الأنسجة الحشرية للأنسجة هو التحدي. وبالتالي، فإنه من الصعب توطين أور إلى نوع معين من سنسيلا باستخدام الحمض النووي الريبي في التهجين الموضع . في هذه الورقة، يتم عرض رنا مفصلة وفعالة للغاية في بروتوكول التهجين الموضعي وخاصة بالنسبة منخفضة التعبير أو الجينات من الحشرات. بالإضافة إلى ذلك، أور محددة جين واs التي تم تحديدها عن طريق إجراء مزدوجة اللون الفلورسنت في الموقع التهجين التجارب باستخدام المشترك التعبير عن الجينات مستقبلات، أوركو ، كعلامة.
Introduction
يتم تغطية هوائيات الحشرات، والتي هي أهم الأجهزة الحسية الكيميائية، مع العديد من الهياكل تشبه الشعر – دعا سنسيلا – التي يتم إدارتها من قبل الخلايا العصبية مستقبلات الشمية (أورنس). على غشاء أورنس الحشرات، يتم التعبير عن مستقبلات أودورانت (أورس)، وهو نوع من البروتين يحتوي على سبعة مجالات الغشاء، مع كورسيبتور (أوركو) لتشكيل هيتيرومر الذي يعمل كقناة أيون الرائحة بوابات 1 ، 2 ، 3 . استجابات مختلفة تستجيب لمجموعات مختلفة من المركبات الكيميائية 4 ، 5 ، 6 .
الجراد ( لوكستا ميغراتوريا ) تعتمد أساسا على العظة حاسة الشم لتحريك السلوكيات الهامة 7 . الجراد الصحراوي الجراد هي العوامل الرئيسية لفهم آليات الشمية الجزيئية. إضفاء الطابع المحلي على الجينات أو الجينات المحددة على الخلايا العصبيةنوع سينسيلوم محددة شكليا من قبل الحمض النووي الريبي في الموقع التهجين (رنا إيش) هو الخطوة الأولى في استكشاف وظيفة أورس.
يستخدم رنا إيش التحقيق المسمى الحمض النووي الريبي التكميلي لقياس وتوطين تسلسل الحمض النووي الريبي معين في قسم من الأنسجة والخلايا أو يتصاعد كله في الموقع ، وتوفير رؤى في العمليات الفسيولوجية والمرض المرضية. وقد استخدمت على نطاق واسع ديغوكيجينين المسمى (ديغ المسمى) وتحقيقات رنا البيوتين المسمى على نطاق واسع في التهجين الحمض النووي الريبي. يمكن إعداد رنا وضع العلامات مع ديغوكيجينين-11-أوتب أو البيوتين 16-أوتب عن طريق النسخ في المختبر مع SP6 و T7 رنا بوليميراز. DIG- والبيوتين المسمى الحمض النووي الريبي تحقيقات لها المزايا التالية: غير المشعة. آمنة؛ مستقرة. حساس للغاية؛ محددة للغاية؛ وسهلة لإنتاج باستخدام ير والنسخ في المختبر . DIG- وبيوتين المسمى رنا تحقيقات يمكن أن يكون الكروموجيني وكشف فلورزنتلي. يمكن الكشف عن تحقيقات رنا المسمى ديغ مع مكافحة ديغوكيجينين القلوين فوسفاتيز (أب) الأجسام المضادة -conjugated التي يمكن تصور إما مع ركائز تشيميلومينسنت حساسة للغاية نيتروبلو كلوريد تيترازوليوم / 5 برومو 4-كلورو 3-إندوليل الفوسفات الملح التولودين (نبت / بسيب) باستخدام المجهر الضوئي أو مع 2 -hydroxy-3-نفتوك أسيد-2'-فنيلانيليد الفوسفات (هنب) إلى جانب 4-كلورو-2-ميثيل بنزينزيونيوم نصف كلوريد الزنك الملح (سريع الأحمر) باستخدام المجهر متحد البؤر. يمكن الكشف عن تحقيقات رنا البيوتين المسمى مع مكافحة البيوتين ستريبتافيدين الفجل الحصان البيروكسيديز (هرب) الأجسام المضادة -conjugated التي يمكن تصور مع فلوريسئين-تيراميدس باستخدام المجهر متحد البؤر. وهكذا، يمكن أن يؤديها ثنائي اللون الفلورسنت في التهجين الموضعي للكشف عن اثنين من الجينات المستهدفة في شريحة واحدة باستخدام DIG- والبيوتين المسمى الحمض النووي الريبي تحقيقات.
وقد استخدمت إيش رنا مع DIG- و / أو تحقيقات البيوتين المسمى بنجاح لتوطين الجينات ذات الصلة حاسة الشم، مثل أور ، مستقبلات المؤلمة، بروتين ملزمة الرائحةوبروتين غشاء الخلايا العصبية الحسية، في هوائيات الحشرات، ولكن ليس على سبيل الحصر، ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر ، الأنوفيلة غامبيا ، L. ميغراتوريا والجراد الصحراوي ششيستوسيرا غريغاريا 8 ، 9 ، 10 ، 11 ، 12 ، 13 ، 14 ، 15 ، 16 . ومع ذلك، هناك اثنين من التحديات الكبيرة عند تنفيذ إيش الحمض النووي الريبي ل أورس الحشرات: (1) أو الجينات (باستثناء أوركو ) وأعرب عن مستويات منخفضة وفقط في عدد قليل من الخلايا، مما يجعل الكشف عن إشارة صعبة للغاية، و (2) الحفاظ على الأنسجة الحشرات ل الأنسجة، بحيث يتم الحفاظ على التشكل والضجيج الخلفية منخفضة، يمكن أن يكون تحديا. في هذا البحث ورقة مفصلة وفعالة تصف إيش الحمض النووي الريبي لتوطين أو الجينات في الحشراتيتم عرض هوائيات، بما في ذلك كل من كروموجينيك وتيراميد إشارة التضخيم (تسا) الكشف.
Protocol
Representative Results
Discussion
من الصعب إجراء رنا إيش لتوطين أو جينات في هوائيات الحشرات لأن مستويات التعبير من الجينات أور، باستثناء أوركو ، منخفضة جدا والحفاظ على شرائح نسيجية من هوائيات الحشرات من الصعب جدا. وبالإضافة إلى ذلك، كشف تسا هو أيضا صعبة جدا. ولمعالجة هذه المشاكل، ينبغي اتخاذ الت…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا العمل من منحة من مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية في الصين (No.31472037). إن ذكر الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية في هذه المقالة هو فقط لغرض تقديم معلومات محددة ولا يعني التوصية.
Materials
| Materials | |||
| 2×TSINGKETM Master Mix | TSINGKE, China | TSE004 | |
| RNase-free H2O | TIANGEN, China | RT121-02 | |
| REGULAR AGAROSE G-10 | BIOWEST, SPAIN | 91622 | |
| Binding buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Balance buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Wash solution | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| T Vector | Promega, USA | A362A | |
| T4 DNA Ligase | Promega, USA | M180A | |
| Escherichia coli DH5α | TIANGEN, China | CB101 | |
| Ampicillin | Sigma, USA | A-6140 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Inalco, USA | 1758-1400 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside | SBS Genetech, China | GX1-500 | |
| Nco I | BioLabs, New England | R0193S | |
| Spe I | BioLabs, New England | R0133M | |
| DIG RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| Biotin RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11685597910 | |
| DNase | DIG RNA Labeling Kit, Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| LiCl | Sinopharm, China | 10012718 | |
| Ethanol | Sinopharm, China | 10009257 | |
| Acetic acid | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Netherlands | 4583 | |
| Slides | TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, China | FISH0010 | |
| HCl | Sinopharm, China | 80070591 | |
| Millex | Millipore, USA | SLGP033RS | |
| Tween 20 | AMRESCO, USA | 0777-500ML | |
| Nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine salt | Roche, Switzerland | 11175041910 | |
| Glycerol | Sinopharm, China | 10010618 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | V900483-1KG | 0.04mol/L Tris-Base |
| 1×Tris-acetate-EDTA | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | 0.12%acetic acid |
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | 03677 | Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | Sinopharm, China | 10019392 | 10g/L NaCl |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM335231 | 10g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM361526 | 5g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | Sinopharm, China | 10019392 | 10g/L NaCl |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM335231 | 10g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM361526 | 5g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | WISENT ING, Canada | 800-010-CG | 15g/L Agar Bacteriological Grade |
| 10×phosphate buffer saline (pH7.1) | Sinopharm, China | 10019392 | 8.5%NaCl |
| 10×phosphate buffer saline (pH7.1) | Sigma, USA | V900041-500G | 14mM KH2PO4 |
| 10×phosphate buffer saline (pH7.1) | Sigma, USA | V900268-500G | 80mM Na2HPO4 |
| 10×Tris buffered saline (pH7.5) | Sigma, USA | V900483-1KG | 1M Tris-Base |
| 10×Tris buffered saline (pH7.5) | Sinopharm, China | 10019392 | 1.5M NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH9.5 TSA detection pH8.0 | Sigma, USA | V900483-1KG | 100mM Tris-Base |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH9.5 TSA detection pH8.0 | Sinopharm, China | 10019392 | 100mM NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH9.5 TSA detection pH8.0 | Sigma, USA | V900020-500G | 50mM MgCl2·6H2O |
| 20×saline-sodium citrate (pH7.0) | Sinopharm, China | 10019392 | 3M NaCl |
| 20×saline-sodium citrate (pH7.0) | Sigma, USA | V900095-500G | 0.3M Na-Citrate |
| 4% paraformaldehyde solution (pH9.5) | Sigma, USA | V900894-100G | 4% paraformaldehyde |
| 4% paraformaldehyde solution (pH9.5) | Sigma, USA | V900182-500G | 0.1M NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH10.2) | Sigma, USA | V900182-500G | 80mM NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH10.2) | Sigma, USA | S7795-500G | 120mM Na2CO3 |
| Formamide Solution (pH10.2) | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Formamide Solution (pH10.2) | 5×saline-sodium citrate | ||
| Blocking Buffer in Tris buffered saline | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1% Blot |
| Blocking Buffer in Tris buffered saline | AMRESCO, USA | 0694-500ML | 0.03% Triton X-100 |
| Blocking Buffer in Tris buffered saline | 1×Tris buffered saline | ||
| Alkaline phosphatase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/ml anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase solution | Blocking Buffer in Tris buffered saline | ||
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/ml anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 1% anti-biotin streptavidin horse radish peroxidase- conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Blocking Buffer in Tris buffered saline | ||
| Hybridization Buffer | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Hybridization Buffer | 2×saline-sodium citrate | ||
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D8906-50G | 10% dextran sulphate |
| Hybridization Buffer | invitrogen, USA | AM7119 | 20 µg/ml yeast t-RNA |
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D3159-10G | 0.2 mg/ml herring sperm DNA |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate (10mg/ml) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt (25mg/ml) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Detection Buffer | ||
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 2% fluorescein-tyramides |
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | Amplification Diluent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | |||
| Freezing microtome | Leica, Nussloch, Germany | Jung CM300 cryostat | |
| Spectrophotometer | Thermo SCIENTIFIC, USA | NANODROP 2000 | |
| Optical microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus IX71microscope | |
| Confocal microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus BX45 confocal microscope |
Referenzen
- Sato, K., et al. Insect olfactory receptors are heteromeric ligand-gated ion channels. Nature. 452 (7190), 1002-1006 (2008).
- Smart, R., et al. Drosophila odorant receptors are novel seven transmembrane domain proteins that can signal independently of heterotrimeric G proteins. Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 770-780 (2008).
- Wicher, D., et al. Drosophila odorant receptors are both ligand-gated and cyclic-nucleotide-activated cation channels. Nature. 452 (7190), 1007-1011 (2008).
- Carey, A. F., Wang, G., Su, C. Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature. 464 (7258), 66-71 (2010).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
- Wang, G., Carey, A. F., Carlson, J. R., Zwiebel, L. J. Molecular basis of odor coding in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4418-4423 (2010).
- Hassanali, A., Njagi, P. G., Bashir, M. O. Chemical ecology of locusts and related acridids. Annu Rev Entomol. 50, 223-245 (2005).
- Schaeren-Wiemers, N., Gerfin-Moser, A. A single protocol to detect transcripts of various types and expression levels in neural tissue and cultured cells: in situ hybridization using digoxigenin-labeled cRNA probes. Histochemistry. 100 (6), 431-440 (1993).
- Vosshall, L. B., Amrein, H., Morozov, P. S., Rzhetsky, A., Axel, R. A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna. Cell. 96 (5), 725-736 (1999).
- Yang, Y., Krieger, J., Zhang, L., Breer, H. The olfactory co-receptor Orco from the migratory locust (Locusta migratoria) and the desert locust (Schistocerca gregaria): identification and expression pattern. Int J Biol Sci. 8 (2), 159-170 (2012).
- Schultze, A., et al. The co-expression pattern of odorant binding proteins and olfactory receptors identify distinct trichoid sensilla on the antenna of the malaria mosquito Anopheles gambiae. PLoS One. 8 (7), e69412 (2013).
- Xu, H., Guo, M., Yang, Y., You, Y., Zhang, L. Differential expression of two novel odorant receptors in the locust (Locusta migratoria). BMC Neurosci. 14, 50 (2013).
- Saina, M., Benton, R. Visualizing olfactory receptor expression and localization in Drosophila. Methods Mol Biol. 1003, 211-228 (2013).
- Guo, M., Krieger, J., Große-Wilde, E., Mißbach, C., Zhang, L., Breer, H. Variant ionotropic receptors are expressed in olfactory sensory neurons of coeloconic sensilla on the antenna of the desert locust (Schistocerca gregaria). Int J Biol Sci. 10 (1), 1-14 (2013).
- You, Y., Smith, D. P., Lv, M., Zhang, L. A broadly tuned odorant receptor in neurons of trichoid sensilla in locust, Locusta migratoria. Insect Biochem Mol Biol. 79, 66-72 (2016).
- Jiang, X., Pregitzer, P., Grosse-Wilde, E., Breer, H., Krieger, J. Identification and characterization of two “Sensory Neuron Membrane Proteins” (SNMPs) of the desert locust, Schistocerca gregaria (Orthoptera: Acrididae). J Insect Sci. 16 (1), 33 (2016).
- Angerer, L. M., Angerer, R. C., Wilkinson, D. G. In situ. hybridization to cellular RNA with radiolabelled RNA probes. In situ hybridization. , 2 (1992).
- Komminoth, P., Merk, F. B., Leav, I., Wolfe, H. J., Roth, J. Comparison of 35S- and digoxigenin-labeled RNA and oligonucleotide probes for in situ hybridization. Expression of mRNA of the seminal vesicle secretion protein II and androgen receptor genes in the rat prostate. Histochemistry. 98 (4), 217-228 (1992).
- Leary, J. J., Brigati, D. J., Ward, D. C. Rapid and sensitive colorimetric method for visualizing biotin-labeled DNA probes hybridized to DNA or RNA immobilized on nitrocellulose: Bio-blots. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (13), 4045-4049 (1983).
- Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna. Cell. 117 (7), 965-979 (2004).
- Jones, W. D., Nguyen, T. A., Kloss, B., Lee, K. J., Vosshall, L. B. Functional conservation of an insect odorant receptor gene across 250 million years of evolution. Curr Biol. 15 (4), R119-R121 (2005).
