相分离巨 unilamellar 囊泡 (GUVs) 的实验常忽略生理溶液的条件。本文研究了盐缓冲液在荷电多组分 GUVs 中液体液相分离中的作用, 作为反式膜溶液不对称和温度的函数。
相分离的巨型 unilamellar 囊泡 (GUVs) 表现为共存的液序和液体无序域, 是研究脂筏假说的常用生物物理工具。然而, 许多研究忽视了生理解决条件的影响。在该帐户上, 目前的工作提出了盐缓冲和反式膜溶液不对称的影响, 液液相分离的 GUVs 生长从 dioleylphosphatidylglycerol, 鸡蛋磷脂, 胆固醇。研究了等温和不同温度条件下的影响。
本文介绍了在对称和非对称盐溶液条件下, 适用于监测带电泡中共存液域稳定性的设备和实验策略。这包括在高温盐缓冲液中制备带电的多组分 GUVs 的方法。该协议要求在最小化囊泡稀释的同时, 通过一个简单的稀释步骤来进行局部交换的外部溶液的选择。另一种方法是利用微流体设备, 允许一个完整的外部解决方案交换。在不同温度下, 对相分离的溶液效应也进行了研究。为此, 我们提出了一个 in-house 内置温度控制室的基本设计和实用。此外, 我们还考虑了对老爹阶段状态的评估、与之相关的陷阱以及如何绕过它们。
自从用荧光显微镜观察液液相分离巨 unilamellar 泡 (GUVs) 中的微米畴后, GUVs 已被用作研究脂筏假说的模型系统1,2,3. 由于它们的独立双层的区域位于从生物细胞的范围内, 它们是适合假设的筏的等离子体膜的模拟。大量的研究对这种 GUVs 已进行了泡在纯净水, 蔗糖或盐分解决方案4,5,6,7,8。然而, 这些条件并不反映生物膜对盐环境和反式膜溶液不对称性的生理相关暴露, 这是细胞的条件。
在这项工作和在我们的小组的早先出版物9, 被审查的被充电的多组分 GUVs 的阶段状态作为盐和解答不对称的存在的作用在细胞膜。GUVs 是从不同比例的 dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG), 鸡蛋磷脂 (eSM), 和胆固醇 (在蔗糖溶液 (与渗透 210 mOsm/千克) 或盐缓冲 (100 毫米氯化钠, 10 毫米三, pH 7.5, 210 的混合物制备。mOsm/千克)。脂质选择由在这个混合物的相图已经获得的数据辩解了6,8。
在文献10,11,12 (注意, 在这里, 我们将不考虑那些涉及脂质从油基转移到水相的方法)。13,14因为膜中剩余的油残留物可能会影响相行为的固有危险。盐缓冲区中 GUVs 的制备与特定的挑战有关。对于低离子强度的解决方案, electroformation 方法15,16提供了一种快速的方法来准备 GUVs 的高收益率和小缺陷10,17。该方法的基础是在导电表面 (电极) 上沉积一层脂质, 将其烘干, 并在应用交流电场时用水溶液对其进行保湿。但是, 如果盐水存在于水溶液18,19中, 则此方法需要进行调整。假定 electroformation 的泡生长驱动力为电16 , 在高电导率20中受阻。因此, GUVs 在盐溶液中的 electroswelling 不是一个简单的方法, 因为它需要对溶胀溶液中存在的不同盐浓度进行优化。凝胶辅助囊泡肿胀21,22是一个潜在的替代 electroformation 与更快速的形成时间。这种方法建立在增强的脂质膜水合时, 凝胶 (琼脂糖或聚乙烯醇 (PVA)) 作为基板使用。然而, 这些方法, 在 agarose-based 肿胀23和/或温度限制的情况下, 出现膜污染的风险, 如 PVA-based 肿胀。同样, 在纤维素纸基材上生长 GUVs 的协议最近已经建立了24。该方法的一般问题是缺乏对基质纯度的控制以及大量的脂质的使用。在这项工作中, 我们将介绍和提出的优势, 最传统的方法为老爹准备, 即自发肿胀方法25,26。它包括在拒水基板上干燥一个脂质层, 在水汽的大气中使其水化, 并在所需的溶胀溶液中随后膨胀 (请参见图 1和协议部分中的详细信息)。这种方法不提供控制的囊泡大小分布和结果的整体较小的小泡相比, 方法的生产是辅助的电场, 聚合物基板或微流控手段。然而, 囊泡的质量和大小是适当的检查膜相状态的探讨这里。
在囊泡膜的溶液之间产生不对称也与某些挑战有关。一个常用的方法是直接稀释泡悬浮在所需的外部解决方案27,28。然而, 这也减少了囊泡分布密度。另一种策略是在流单元的底部缓慢地交换外部解决方案, GUVs 可以解决 in-and outflux。为了避免干扰或甚至失去流动的小泡, 低流速应用了8, 这使得这种方法 time-inefficient。此外, 这两种方法都不能保证完全的外部解决方案交换。一个明显的解决办法是固定囊泡以避免在外部溶液交换过程中失去它们。例如, 化 GUVs 可以被拴在一个亲和涂层的表面29上。然而, 这种方法可能导致在粘附的和因此 non-adhered 膜段30,31的成分变化。磁场或电场在陷阱泡中的应用导致膜张力32。使用光镊诱捕囊泡需要有一个手柄附加 (即珠), 而光学担架的用途可能涉及局部加热33。GUVs 的捕获也可以通过在没有最终剥离34的情况下在铂线上生长来实现。然而这导致囊泡没有被隔绝, 并且通常连接到导线或其他小泡由稀薄的油脂管 (系)。
所介绍的工作突出了克服上述限制的战略。我们首先介绍了自适应和优化的自发肿胀法的 GUVs 在盐缓冲区生产的详细描述。然后, 我们引入了两种方法, 通过简单的稀释或利用微流体设备来有效地创建非对称的溶液条件。由于我们的目标是分析 GUVs 在不同的溶液条件下的膜相状态, 随后的章节描述了成功的统计分析的标准, 并提出了避免错误分类的提示。
在等温条件下以及在不同温度下进行了分析。温度 c控制是普遍使用的, 关于实验温度控制室的细节很少被描述。在这里, 一个 in-house 建立在不同温度条件下观察 GUVs 的设置。
对称和非对称盐条件下的相态观测 GUVs 的成功生产
这里提出的协议介绍了一种策略来评估盐缓冲和溶液不对称对膜相状态的荷电 GUVs 在广泛的组合物的影响。实现这一目标的主要挑战之一是在盐缓冲区中生产带电的 GUVs。
我们成功地生产了 GUVs 在蔗糖溶液和 high-saline 缓冲的简单自发肿胀方法, 其中包括 pre-hydration 步骤的沉积脂质膜和隔夜最后水化步骤的囊泡生长。重要的是要注意, 脂质沉积应在粗糙的聚四氟乙烯板, 以确保均匀的脂质传播, 以产生 unilamellar 泡。此外, 它是必不可少的执行每一个步骤, 在囊泡准备在一个温度下, 脂质膜是在一个均匀和液相状态。另外, 囊泡的数量可能是多的, 并对最终的种群阶段状态分析产生偏见。GUVs 自发肿胀的具体协议产生一个囊泡丛, 它一方面提供了 re-suspend 小体积以获得高度浓缩的囊泡分散体的可能性, 另一方面提供了不对称的溶液通过膜的条件, 同时尽量减少泡的稀释8,28。重要的是, 在囊泡稀释或外部溶液交换, 内外 osmolarities 保持匹配的形态学变化引起的渗透不匹配可能诱发或防止 Lo + Ld 相分离41或, 在低渗的情况下条件, 可能导致囊泡爆裂。
在这里, 试图优化 electroformation 协议在盐的解决方案导致生产无 GUVs, 而 PVA 辅助肿胀产生多层泡。尽管它需要更长的准备时间和结果在小泡批次的低质量10,17, 成功生产的带电泡由自发肿胀带来了额外的优势。它要求最小的努力, 而导致足够的收益率统计批次分析, 不像 electroformation, 不需要先进的设备或优化。此外, 没有任何污染物的脂质氧化已观察到42,43。根据文献, 囊泡的脂质组成与它们生长的相应种群之间没有差异7,17。此外, PTFE 衬底上的泡形成不提示包含任何污染物与凝胶辅助肿胀方法, 在这种情况下, 外分子可能由基底23引入。Electroformation 在创造不对称的溶液条件时会伴随着过多的囊泡稀释而产生更多的缺陷。GUVs 产生的 electroformation 通常是作为一个均匀的分散 (与高度集中的囊泡悬浮在自发肿胀形成的形式形成对比)。任何稀释的外部溶液也会极大地稀释囊泡的数量。此外, 在这项工作的过程中观察到, electroformation 在蔗糖中产生的 DOPG/eSM/GUVs 在盐缓冲液中稀释后变得不稳定。显微镜下的脂质片上的荧光表明, 囊泡在视力检查之前会破裂。这种不稳定性可归因于 electroformation 制备的囊泡膜张力升高, 与自发肿胀的10相比。
虽然囊泡稀释是一种简单而快速的方法来创建不对称的老爹解决方案条件, 它只完成了部分外部解决方案交换, 虽然是一个很高的分数 (这里: 95%,图 2), 作为稀释后的痕迹肿胀解决方案将保持。外部溶液交换的程度的选择是在移与肿胀溶液 (2 节) 之间的平衡, 而不是稀释太多。因此, 我们介绍了一种替代的微流控方法, 在其他地方详细讨论了37 , 允许在老大阶段状态观测期间进行快速和完整的外部解决方案交换, 以验证为稀释而进行的相位状态观测泡.在从对称到非对称溶液条件的变化时, 观测到的相位状态变化确实是一致的。此外, 这两种生成非对称解决方案条件的方法都是比较快速的 (对比 Ref.8), 并没有任何已知的本地组合更改风险 (比较引用30、31),增加膜张力 (比较参考32), 或局部加热 (比较参考33), 至于介绍中讨论的替代方法。在微流体捕获过程中, 囊泡内部与外部的渗透平衡不仅是避免上述阶段状态伪影的必要条件, 而且是高渗溶液条件引起的通货紧缩, 可能导致被困 GUVs 滑倒通过外部解决方案交换后的帖子。
即使自发肿胀已成功地应用于生长不泡从 DOPC/eSM/系统, 在其他情况下, 没有收费可能会损害老爹肿胀, 由于导致缺乏排斥之间的个人双层44.延长 pre-swelling 期或引入笨重的脂质 headgroups 可能会解决此问题45。此外, 在不同于肿胀的溶液中, 其稀释后的囊泡稳定性可能因不同的脂质成分和稀释介质而不同, 这是我们没有研究过的。我们也没有探索的可能性, 调整的平均老大直径与准备方法在这里提出。但囊泡成分和溶胀液等参数可能影响结果。替代方法的应用46可能会产生更大的脂肪泡和在这里使用的解决方案, 但是, 它们可能会带来与该方法相关的其他缺点。在对称和非对称盐条件下产生 GUVs 的上述方法为进一步研究由不同的脂质组成和分散在不同的培养基中的囊泡提供了一个潜在的工具。由于我们没有探索这些可能性, 未来的试验将显示如何一般的老爹准备和稀释方法可以应用。
在不同温度下观察相分离
不同的实验设置适合研究 GUVs 在不同的温度下存在。虽然这些设置在文献中并不经常被详细描述, 但当前的工作呈现了一个适用于此类研究的基本组件。
_content “>> 控制测量表明, 该 in-house 设计和建造室的温度精确控制的恒温器和温度梯度内的会议厅是在实验温度的决议。确保实验热条件与恒温器读数一致。
在广泛的温度范围内对老大相状态进行评估时, 观察到的泡在温度变化后平衡很重要。一个可能的方法, 以确保这是检查滞后。如果存在滞后, 则应降低温度步骤并/或平衡时间增加。由于温度控制在这工作由一个水基恒温器建立, 工作温度的范围理想地被限制到 0-100 ° c。这个范围可以通过使用其他温度控制液体, 如油或通过其他设置,例如一个珀尔贴设备扩展。在实践中, 工作温度也受到可能的凝结或蒸发的限制。此外, 对于远离室温的温度, 整个观察室的稳态温度梯度的发生变得更有可能。此外, 成像设备可能会在极端温度下受到伤害。为典型的温度范围适当为脂囊研究 (~ 10-50 ° c7,9) 对观察设备的损坏应考虑, 但通常不预期。
囊泡领域观察工件
有许多来源的观察文物使用广域荧光显微镜。首先, 我们应该知道, 应用于囊泡相状态目视检查的对象的最大分辨率r决定了脂域的检测限度, 其依据是:
其中, λ是发射波长, NA 是目标的数字光圈。一个典型的目标与40x 放大率和 NA 的 0.6, 检测绿色发射光约 560 nm 将达到0.6 µm 的光学分辨率. 因此, 比较不同的特定脂质混合物的囊泡相状态的研究对于相同的脂质混合物, 条件应使用相同的目标。
另一个工件是脂质领域的发生, 由于脂质光氧化的结果, 由于延长暴露于激发光41。光损伤优先于不饱和烃类脂基。事实上, 对于某些脂类成分, 在经过长时间的激发光照射 (~ 三十年代) 之后, 在这里观察到了最初均匀泡的区域形成。为了解决这个问题, 励磁灯被集中在一个视野, 仅几秒钟的时间状态评估。因此, DiIC18适用于我们的目的。然而, 其他染料, 可能会更敏感, 可能需要在较低的激发强度和更短的励磁光照射时间处理。
机械剪切应力从吸管转移的囊泡可能暂时混合领域, 从而扭曲明显的囊泡相行为。在某些批次中, 不同的囊泡在吸管转移到显微镜片后表现出不同的相行为0分钟和5分钟。在微流控装置中流体流动引起的剪切应力也被证明在域混合47。在观察之前, 囊泡应该被不受干扰地留出足够的时间平衡。在这项研究中, 被困在微流控装置上的囊泡在观察前的囊泡加载和溶液交换后未受干扰1小时。
为了避免一些 above-mentioned 的困难以及光衍射极限施加的限制, 诸如核磁共振光谱学48或超分辨率显微镜技术的替代方法49可以使用。
结论与展望
所介绍的工作演示了一套方法, 允许分析盐对称和非对称溶液条件对膜相分离的影响。所提出的方法都适用于其他应用。以微流控器件为例, 给出了在溶液不对称诱导下的区域形成和消失动力学的研究平台。此外, 领域的外观作为一个盐浓度的功能可以检查的方式。所有的方法也可以用来观察对相位行为的影响使用任何其他的解决方案的利益。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是 MaxSynBio 财团的一部分, 由德国联邦教育和研究部和马克斯·普朗克协会联合出资。
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol), sodium salt | Avanti Polar Lipids | 840475C | abbreviated as DOPG in the text |
chicken egg sphingomyelin | Avanti Polar Lipids | 860061 | abbreviated as eSM |
cholesterol (ovine wool, > 98 %) | Avanti Polar Lipids | 700000 | abbreviated as Chol |
1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Molecular Probes | D-282 | abbreviated as DiIC18 |
Chloroform, HPLC grade (≥ 99.8 %) | Merck | ||
NaCl (> 99.8 %) | Roth | ||
HCl (37 %) | Roth | ||
Tris (≥ 99.9 %) | Roth | ||
Sucrose (≥ 99.5 %) | Sigma Aldrich | ||
Parafilm | |||
Threaded vial 45×27 mm, 15 mL | Kimble | Soda flat bottom, white screw cap | |
pH meter | Mettler Toledo | MP220 | |
Osmometer | Gonotec | Osmomat030 | |
Epi-fluorescence microscope | Zeiss | Axio Observer D1 | |
Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5 | |
Objective 40x, 0.6 NA | Zeiss | LD Achroplan | |
Objective 40x, 0.75 NA | Leica | 506174 | |
Objective 63x, 0.9 NA | Leica | 506148 | |
Microscope slide, 56×26 mm, 0.17 ± 0.01 mm | Menzel-Gläser | ||
Cover slip, 22×22 mm, 0.17 ± 0.01 mm | Menzel-Gläaser | ||
Parafilm "M" | Bremix Flexible Packaging | ||
Syringes, 5 mL, 10 mL | Braun | ||
0.45 µm syringe filter | GVS North America | Cameo 25AS, 1213723 | Acetate, sterile |