수동 선명도 삭제 마우스 난소의 혈관 구조의 3 차원 재구성
1Department of Integrative Medicine and Neurobiology, School of Basic Medical Sciences; Institutes of Brain Science, Brain Science Collaborative Innovation Center, State Key Laboratory of Medical Neurobiology, Institute of Acupuncture and Moxibustion, Fudan Institutes of Integrative Medicine,Fudan University, 2Program of Reproductive and Stem Cell Biology, Department of Obstetrics and Gynecology, Stanford University School of Medicine,Stanford University
Summary
여기 우리는 그대로 마우스 난소에서 수동 선명도 난소 맥 관 구조 및 follicular 모세 혈관의 시각화를 위한 3D 재구성 방법의 적응을 제시.
Abstract
난소는 여성의 생식 시스템의 주요 기관 이다 하 고 여성 gametes의 생산에 대 한 복잡 한 구조 관계와 3 차원 (3D) 맥 관 구조 아키텍처의 내 분 비 시스템을 제어 하기 위한 필수적 이다는 난소는 잘 기술 된다. 3D 연결과 그대로 난소에 혈관의 아키텍처를 시각화 하기 위해 첫 번째 중요 한 단계는 광학 투명 난소를 만드는 것입니다. 피하 조직의 수축, 우리가 사용 하는 하이드로 겔 고정 기반 수동 선명도 (아크릴 때 교배 고정 취소 지질 교환 이미징 / Immunostaining/에서 제자리 교 잡-호환 조직 히드로) 메서드는 그대로 난소를 프로토콜 . Immunostaining, 고급 multiphoton confocal 현미경 검사 법, 그리고 3D 이미지 복원 다음 난소 혈관 및 소 낭 모양 모 세관의 시각화를 위해 사용 되었다. 이 방식을 사용 하 여, 우리는 상당한 긍정적인 상관 관계 보였다 (P < 0.01) follicular 벽의 볼륨과 follicular 모 세관의 길이 사이.
Introduction
여 포는 난소의 기본적인 구조상과 기능 단위 이며 그 개발 높은 난소 내에서 맥 관 구조에 관련 된. 혈관 영양과 모 낭에 호르몬을 공급 하 고 따라서 성장과 낭1의 성숙에 중요 한 역할.
선택적 혈관 마커, 유전자 변형 마우스 모델 및 제약 개발을 포함 하 여 기술의 조합 난소 혈관 네트워크, 신생, 혈관의 기능에 대 한 우리의 지식을 증가합니다 folliculogenesis입니다. 난소는 그것 folliculogenesis와 배 란 기간 동안 다양 한 조직 및 혈관 네트워크를 개장 하기 때문에 활성 장기로 알려져 있다. 혈관의 구조와 크기에 이러한 활성 개장 하는 것은 개발 및 낭의 생물 학적 기능을 위한 필요 이다.
난소 및 혈관의 immunolabeling를 사용 하 여 전통적인 조직학 및 histomorphometric 메서드는 2 차원 (2D) 이미지2. 3 차원 (3D) 재구성 기술 개발 조직 조각의 2D 이미지 3 차원 구조를 만들기 위해 중첩 수 있습니다 하지만이 방법은 여전히 몇 가지 한계가-조직의 단면 마이크로 구조의 일부를 파괴할 수는 조직, 자주 그리고 상당한 노동은 조각에서 얻은 이미지에서 3 차원 개조를 제작에 관련 된. Confocal 현미경 검사 법으로 전체 조직의 3D 영상 많은, 이러한 한계를 극복할 수 있지만 이러한 방법은 배아 난소3신생의 평가에 제한 됩니다. 전체 조직의 선명도4 같은 방법의 선택을 취소를 사용 하 여 산 후 및 성인 난소에 이러한 문제를 해결할 수 있도록 시각화 된 볼륨을 증가 시킬 수 있습니다 그리고 이러한 방법을 모든 구조적 변형 없이 난소의 광학 정리 제공. 그대로 난소의 3D 아키텍처의 이미징이이 작품에 사용 된 Imaris 소프트웨어 패키지 같은 이미지 분석 소프트웨어에 대 한 정확한 이미지 데이터베이스를 제공 합니다.
성인 기에 걸쳐 난소의 개장 동적 생리 체계의 일부 이며 이것은 난소 신생의 규칙에 대 한 조사에 대 한 우수한 모델. 또한, polycystic 난소 증후군이 나 난소 암 등 여성 생식의 pathologic 상태에서 난소 혈관의 역할을 평가 전체 난소 조직 영상 통해 공부 될 수 있다. 수동 선명도 방법의 개발 및 고급 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 혈관과 모 낭 등 난소의 구조 간의 관계에 자세한 공간 정보 제공.
Protocol
동물 주제와 관련 된 모든 절차에서 상해 의학 대학, 복 단 대학 (승인 번호 20160225-013) 동물 윤리 위원회의 지침에 따 랐 다. 1입니다. 투명 마우스 난소의 준비 솔루션의 준비 준비 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 솔루션 (1 M, pH 7.6) 0.1% 트라이 톤 X-100 (PBST). 10 x PBS 재고 솔루션 1 L을 혼합 87 g의 NaCl, NaH2포4 · 3.1 g 2 H2O, 그리고 나…
Representative Results
우리는 수동 난소 follicular와 혈관 구조를 보존 하 고 혈관과 모 낭의 레이블이 표시에서 높은 형광 신호를 취득 하는 동안 지우기에 대 한 신속 하 고 간단한 방법으로 수동 선명도 메서드를 적응. Follicular 맥 관 구조의 3D 아키텍처 CD31, 내 피 세포6표식에 대 한 immunostaining에 의해 결정 되었다. 필 라 멘 트 알고리즘을 사용 하 여 및 follicular 모 세관 및 기본…
Discussion
현재 연구에서 선물이 3D 이미징 모세 혈관과 개별 성장 낭 사이의 관계를 평가 하기 위해. 우리의 이전 작품에서는 동일한 프로토콜 9를 사용 하 여, 우리는 큰 맥 관 구조, 모 공, 그대로 마우스 난소에서 난 포의 위치 사이 상호 작용의 역할을 공부 했습니다. 수동 선명도 접근 수 마이크로 및 매크로 vasculatures, folliculogenesis, corpora lutea의 다른 발달 단계에서 난소 아키텍처를 재구…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 초나라에 대 한 중국 특별 기금에서 교부 금에 의해 지원 되었다 (YF No. 2014T70392), 국립 자연 과학 재단의 중국 YF (No. 81673766), 새로운 교사를 못쓰게 기금, 복 단 대학의 Zuoxue 재단 및 개발 상하이 최대 분야 통합 의학 (20150407)의 프로젝트.
Materials
| Acrylamide | Vetec | v900845 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845 |
| Alexa Flour 488 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11039 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039 |
| Alexa Flour 594 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11012 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012 |
| Bisacrylamide | Amresco | 172 | http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx |
| Black wall glass bottom dish (Willco-Dish) | Ted Pella | 14032 | http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall |
| Boric acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10004818 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818 |
| Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4 12H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 10020318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318 |
| FocusClear | Celexplorer | FC-102 | http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1 |
| Parafilm | Bemis | PM996 | http://www.parafilm.com/products |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618 |
| PECAM1/CD31, platelet-endothelial cell adhesion molecule 1 (Dilution 1:10) | Abcam | ab28364 | http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html |
| Photoinitiator VA044 | Wako | va-044/225-02111 | http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en®ion=US |
| Sodium chloride (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318 |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 2H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 20040718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718 |
| Sodium dodecyl sulfate | Sinopharm Chemical Reagent | 30166428 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428 |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718 |
| Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent | 30188928 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928 |
| Tyrosine hydroxylase (TH, Dilution 1:50) | Abcam | ab76442 | http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html |
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Hu, W., Tamadon, A., Hsueh, A. J., Feng, Y. Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary. J. Vis. Exp. (130), e56141, doi:10.3791/56141 (2017).