Simple eliminación de la fluorescencia del fondo en el tejido cerebral humano fijados con formol para microscopia de la inmunofluorescencia
Summary
Fondo de Autofluorescencia de las muestras biológicas a menudo complica basada en fluorescencia las técnicas de imagen, especialmente en tejidos postmitotic humanos envejecidos. Este protocolo describe cómo autofluorescence de estas muestras puede eliminarse eficazmente usando un comercialmente disponible luz de diodo electroluminoso fuente para photobleach la muestra antes de la inmunotinción.
Abstract
La inmunofluorescencia es un método común utilizado para visualizar los compartimientos subcelulares y a determinar la localización de proteínas específicas en una muestra de tejido. Un gran obstáculo para la adquisición de imágenes de alta calidad inmunofluorescencia es endógeno autofluorescencia de los tejidos causado por pigmentos como la lipofucsina de envejecimiento o por procesos de preparación de muestra comunes tales como fijación de aldehído. Este protocolo describe cómo fluorescencia del fondo puede ser grandemente reducida por photobleaching utilizando fósforo blanco electroluminoso arreglos de diodos (LED) antes del tratamiento con sondas fluorescentes. La emisión del amplio-espectro de fósforo blanco LEDs permiten blanquear de fluoróforos en una gama de picos de emisión. El aparato de fotoblanqueo puede construir a partir de componentes estándares a muy bajo costo y ofrece una alternativa accesible para extintores químicos disponibles en el mercado. Un tratamiento previo de fotoblanqueo del tejido seguido manchando de la inmunofluorescencia convencional genera imágenes de Autofluorescencia de fondo. En comparación con extintores químicos que reducen la sonda así como fondo de establecer señales, photobleaching tratamiento no tuvo efecto sobre intensidad de fluorescencia de la sonda mientras que efectivamente redujo la fluorescencia de fondo y del lipofuscin. Aunque fotoblanqueo requiere más tiempo de tratamiento previo, pueden utilizarse matrices de LED de mayor intensidad para reducir el tiempo de fotoblanqueo. Potencialmente, este sencillo método puede aplicarse a una variedad de tejidos, los tejidos particularmente postmitotic que acumulan lipofuscina como el cerebro y los músculos cardíacos o esqueléticos.
Introduction
Microscopía de fluorescencia con anticuerpos contra proteínas específicas se utiliza habitualmente para visualizar proteínas de interés en cultivo de células y tejidos. Una complicación importante a la adquisición de imágenes claras y definitivas en la inmunofluorescencia es autofluorescencia, que puede ser causada endógeno en tejidos de mamíferos por la edad del pigmento lipofucsina y por proteínas como la elastina y el colágeno1, 2. Otras fuentes de Autofluorescencia pueden ser introducidos a través de pasos de preparación de la muestra como aldehído fijación3. Gránulos de lipofuscina, compuestos principalmente de proteínas modificadas oxidativamente y residuos de la degradación de lípidos, se acumulan en las células de larga vida con aumento de la edad2. Esto causa dificultades en la proyección de imagen postmitotic tejidos como el cerebro y los músculos esqueléticos o cardiacos, como el espectro de emisión de fluorescencia de lipofuscin es amplio y variable, a menudo coincidiendo con la longitud de onda de emisión de los fluoróforos común utilizado para etiquetado4. Estos factores hacen que la proyección de imagen del tejido de cerebro humano de casos de enfermedades neurodegenerativas de aparición tardía como degeneración lobar frontotemporal (DLFT) especialmente desafiante.
Para reducir la autofluorescencia, hemos ideado una técnica que nos irradian las secciones de tejidos montados en portaobjetos con una arreglo de diodos (LED) usando una lámpara de escritorio hogar5de emisión de luz blanca. Esta técnica simple proporciona una alternativa a las técnicas que utilizan a extintores químicos como CuSO4 en acetato de amonio, o comercialmente disponible Temple colorantes como el Sudán negro B y eriocromo negro T6. También cuenta con importante ahorro de costes sobre multiespectral técnicas de fotoblanqueo de lámpara de LED y evita complicaciones y artefactos generados a partir de métodos de extracción digital autofluorescence como espectral sin mezcla de7,8. Fósforo blanco LED tienen un amplio espectro de emisión, alta luminosidad y fabricación bajo costo, lo que es ideal como un componente estándar de fotoblanqueo diversos cromóforos5,9.
En este protocolo, demostrar la construcción de un aparato de photobleaching con componentes accesibles y fotoblanqueo se aplican a un caso de tejido de DLFT con inclusiones tau-positivas (DLFT-T) utilizando un anticuerpo específico para tau fosforilada. Demostrar el efecto de fotoblanqueo en proyección de imagen anticuerpos marcados con fluorescencia empleando dos cromóforos habituales: Alexa 488 y rojo de Texas. El efecto de fotoblanqueo versus secciones no tratadas o tratados con un extintor químico comercial son cuantificados y comparados. Este tratamiento previo de photobleaching puede ser incorporado en cualquier protocolo de tinción de inmunofluorescencia estándar para quitar autofluorescencia en una muestra biológica.
Protocol
Representative Results
Discussion
El tratamiento previo de fotoblanqueo de tejidos que se describe en este manuscrito permite la eliminación efectiva de Autofluorescencia utilizando componentes estándares. El protocolo describe imágenes de inmunofluorescencia de los agregados de tau fosforilada en tejido formalina-fijo cerebro humano usando los anticuerpos secundarios conjugados a Alexa 488 y rojo de Texas, con DAPI como una contratinción nuclear. Para aplicar el método a otros tejidos, se recomienda realizar un tratamiento previo de fotoblanqueo de…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado en su totalidad o en parte por el Consorcio Canadiense de neurodegeneración y envejecimiento (CCNA), el Instituto canadiense de salud Research (CIHR), la sociedad de ALS de Canadá (Canadá ALS) y la sociedad de Alzheimer de Canadá (ASC). Los autores desean agradecer a Darvesh Sultan y Andrew Reid de la marítima Banco de tejido cerebral para proporcionar los tejidos del cerebro de DLFT, Ganguly de Milán desde el programa de orientación espacio-temporal y la amplificación de la respuesta de la radiación (STTARR) y sus afiliadas financiación de agencias para el tejido inclusión y corte de servicios y la avanzada óptica microscopia instalación (AOMF) para proporcionar instrumentos de microscopía. Kevin Hadley se agradeció a la revisión crítica del manuscrito.
Materials
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Sodium Choloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Hydrochloric Acid | Caledon Laboratory Chemicals | 1506656 | |
| Sodium Azide | BioShop Canada | SAZ001 | |
| 100 mm x 100 mm x 20 mm Pitri dish | Sarstedt | 82.9923.422 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| 6 W LED Dimmable Desk Lamp | DBPower | DS501 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| Citric Acid | Sigma-Aldrich | C-2404 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop Canada | EDT001 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| Sodium Hydroxide | BioShop Canada | SHY700.1 | |
| Water bath | Haake Fisons | K15 | |
| Slide collector | FisherScientific | 12-587-17B | |
| Staining Jar | FisherScientific | E94 | |
| Orbital Shaker | Bellco Glass | 7744-08115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T7878 | |
| Bovine Serum Albumin | FisherScientific | BP1600-1 | |
| Normal Goat Serum | Aurion | 905.002 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z672548-1EA | |
| Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Monoclonal Antibody (AT8) | ThermoFisher | MN1020 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Texas Red-X | ThermoFisher | T862 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-11029 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting medium | ThermoScientific | 28-600-42 | |
| Glass soverslip | |||
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | |
| Imaging software ZEN 2012 Black Edition 11.0 | Zeiss | LSM710 | Software accompanies the Confocal Microscope |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| RGB Profile Tools macro | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt | |
| Commercial chemical quencher | Biotum | 23007 |
Referenzen
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