Müller Glia-Zell-Aktivierung in einer laserinduzierten Netzhautdegeneration und Regeneration Modell im Zebrafisch
Summary
Der Zebrabärbling ist eine beliebte Tiermodell, Mechanismen der retinalen Degeneration/Regeneration bei Wirbeltieren zu studieren. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um lokalisierte Verletzung die äußeren Netzhaut mit minimaler Beschädigung der inneren Retina stören zu induzieren. Anschließend überwachen wir in Vivo die Netzhaut Morphologie und der Müller Gliazellen Antwort in der gesamten Netzhaut Regeneration.
Abstract
Ein faszinierende Unterschied zwischen teleost und Säugetiere ist das lebenslange Potenzial der teleost Netzhaut Netzhaut Neurogenese und Regeneration nach schweren Schäden. Die Regeneration Wege im Zebrafisch untersucht könnte neue Einblicke in innovative Strategien für die Behandlung von degenerativen Erkrankungen der Netzhaut bei Säugetieren bringen. Hierin, konzentrierten wir uns auf die Induktion einer fokalen Läsion an der äußeren Netzhaut in Erwachsenen Zebrafisch mittels einem 532 nm Diodenlaser. Eine lokalisierte Verletzung ermöglicht die Untersuchung biologischer Prozesse, die während retinalen Degeneration und Regeneration direkt auf dem Gelände des Schadens stattfinden. Verwendung von nicht-invasiven optischen Kohärenztomografie (OCT), konnten wir die Position der beschädigte Bereich und Monitor anschließende Regeneration definieren in-vivo. In der Tat produziert OCT-Bildgebung Cross-sectional hochauflösende Bilder der Zebrafisch Netzhaut, Bereitstellung von Informationen, die zuvor nur mit histologischen Analysen verfügbar war. Um die Daten in Echtzeit OCT bestätigen, histologische Abschnitte wurden durchgeführt und regenerative Reaktion nach der Induktion der Netzhaut Verletzung wurde von Immunohistochemistry untersucht.
Introduction
Vision ist wahrscheinlich der wichtigste Sinn des Menschen und seiner Beeinträchtigung hat eine hohe sozio-ökonomische Auswirkungen. In der industrialisierten Welt entfallen degenerative Netzhauterkrankungen die Mehrheit der Sehbehinderung und Blindheit bei der erwachsenen Bevölkerung1. Retinitis Pigmentosa (RP) ist die häufigste erbliche Ursache für Erblindung bei Menschen im Alter zwischen 20 und 60, Auswirkungen auf etwa 1,5 Millionen Menschen weltweit2,3. Es ist eine heterogene Familie von retinalen Erbkrankheiten durch fortschreitenden Verlust der Photorezeptoren (PRs), gefolgt von Degeneration des retinalen Pigmentepithels und anschließend Gliosis und Umbau des inneren Neuronen4gekennzeichnet. Der Krankheitsverlauf lässt sich erklären durch den inkrementellen Verlust der PR zwei Zelltypen, Stangen, die sind verantwortlich für achromatische Vision im Dämmerlicht und Zapfen, die für Color Vision und Sehschärfe5sind in der Regel ab. Ein einzelnes Gendefekt reicht für RP. Bisher wurden mehr als 130 Mutationen in mehr als 45 Genen verbunden mit der Krankheit-6. Dies führt zu unterschiedlichen Phänotypen der Krankheit und ist einer der Gründe, die Gentherapie nicht verallgemeinerbare ist und somit eine komplexe therapeutische Ansatz. Daher ist dringend erforderlich, neue allgemeine Therapieansätze zur Behandlung von retinaler Degenerationen in blendenden Krankheiten zu entwickeln.
Netzhautdegeneration oft schließt PR Verlust; Daher ist PR Zelltod ein Markenzeichen für die degenerativen Prozesse in der Netzhaut-7. Es wurde bereits nachgewiesen, dass PR Zelltod Müller Glia Zelle (MC) Aktivierung und Proliferation8stimuliert. MCs, großen glialen Zelltyp in der vertebrate Retina galten einmal als nichts anderes als ein “Klebstoff” zwischen Netzhaut Neuronen. In den letzten Jahren haben viele Studien gezeigt, dass MCs zu handeln, als mehr als bloße strukturelle9unterstützen. Unter den verschiedenen Funktionen MCs beteiligen sich auch an Neurogenese und10zu reparieren. In der Tat, in Reaktion auf diffusiblem Faktoren von der degenerierenden Netzhaut, MCs deutlich erhöhen glial fibrillary sauer (GFAP) Proteinexpression. Daher kann als Marker für MC Aktivierung als sekundäre Reaktion auf Netzhaut Verletzung und Degeneration11GFAP Kennzeichnung verwendet werden.
Vor kurzem haben wir eine neuartige Anpassung der fokalen Verletzungen mit Hilfe eines Lasers induzieren Netzhautdegeneration im Zebrafisch (Danio Rerio) entwickelt. Fokalen Verletzung ist vorteilhaft für das Studium bestimmte biologische Prozesse wie die Wanderung von Zellen auf der verletzten Seite und der genaue Zeitpunkt der Ereignisse, die während der Netzhaut Regeneration12stattfinden. Darüber hinaus ist der Zebrabärbling aufgrund der Ähnlichkeiten zwischen seine visuellen System und dem von anderen Wirbeltieren in visuelle Forschung wichtig geworden. Grobe morphologischen und histologischen Merkmale des menschlichen und teleost Netzhaut zeigen einige Unterschiede. Dementsprechend enthalten Mensch und Zebrafisch Netzhaut die gleichen großen Zelle Klassen organisiert in dem gleichen geschichteten Muster, wo lichtempfindlichen Photorezeptoren die äußerste Schicht, besetzen, während die Netzhaut Projektion Neuronen, die Ganglienzellen im Innersten wohnen neuronalen Ebene, proximal an der Linse. Die Netzhaut Interneuronen, die amakrinen, bipolar, und horizontalen Zellen zwischen den Photorezeptoren und Ganglienzellen Zelle Schichten13zu lokalisieren. Darüber hinaus ist die Zebrafisch Netzhaut Kegel beherrscht und daher näher an der menschlichen Netzhaut als zum Beispiel intensiv studierte Nagetier Netzhaut. Ein faszinierende Unterschied zwischen teleost und Säugetiere ist die anhaltende Neurogenese in Fisch Netzhaut und Netzhaut Regeneration nach Schaden. Im Zebrafisch können MCs Gewebestammzelle und Regeneration im geschädigte Netzhaut14,15vermitteln. Bei Hühnern haben MCs einige Fähigkeit auch, geben Sie den Zellzyklus und Gewebestammzelle. Nach Netzhaut Verletzung bei Erwachsenen Fischen MCs übernehmen bestimmte Merkmale der Stammvater und Stammzellen, migrieren, die beschädigte Netzhautgewebe und produzieren neue Neuronen16. Gen Expression profiling von Säugetieren MCs offenbart unerwartete Ähnlichkeiten mit retinalen Stammväter, und Beweise für die innewohnende Potenzial neurogenen MCs im Huhn, Nager und auch die menschliche Netzhaut wächst17. Dennoch, warum die regenerative Antwort in Vögel und Säugetiere niedriger, verglichen mit der starke Reaktion in Fisch ist noch nicht geklärt. Daher kann die körpereigene Reparaturmechanismen im Zebrafisch Verständnis Strategien für anregende retinalen Regeneration bei Säugetieren und beim Menschen vorschlagen. Einsatz der körpereigene Reparaturmechanismus der MCs als therapeutisches Werkzeug für die Behandlung von Patienten mit Netzhautdegeneration hervorragend für unsere Gesellschaft auswirken würde.
Hier bieten wir Ihnen die notwendigen Schritte zur Degeneration/Regeneration Modell in Augenheilkunde beschäftigen. Wir konzentrierte sich zunächst auf Induktion fokalen Schäden in der neurosensorischen Netzhaut, dann auf die Darstellung der Ereignisse am Verletzung Aufstellungsort und schließlich visualisieren Beteiligung der benachbarten MCs entwickeln. Das allgemeine Protokoll ist relativ einfach durchzuführen und öffnet eine Vielzahl von Möglichkeiten für die Bewertung der Netzhaut danach.
Protocol
Representative Results
Discussion
Regeneration/Degeneration der Netzhaut in der Zebrabärbling wurde durch verschiedene Ansätze wie Zytotoxin-vermittelte Zelle Tod22, mechanische Verletzungen23und thermische Schädigung24untersucht. Wir beschäftigten 532 nm Diodenlaser die Zebrafisch Netzhaut beschädigen. Unser Modell bietet dabei mehrere Vorteile. Zum Beispiel haben wir schnell einen klar umrissenen Bereich der Verletzung in der äußeren Netzhaut, speziell in der PRs-Schicht lok…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Martin Zinkernagel, MD, PhD und Miriam Reisenhofer, PhD für ihre wissenschaftlichen Beiträge zur Festsetzung von Modell und Federica Bisignani für ihre hervorragenden technischen Betreuung.
Materials
| Acid hematoxylin solution | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2852 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A07030 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 5470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| DAPI mounting medium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosin G aqueous solution 0.5% | Carl Roth, Arlesheim, Switzerland | X883.2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2860 | |
| Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | ED | |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 3989 | |
| Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 488 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11008 | |
| Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor® 594 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11020 | |
| Goat normal serum | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Hydrogel contact lens | Johnson & Johnson AG, Zug, Switzerland | n.a. | 1-Day Acuvue Moist |
| Hydroxypropylmethylcellulose 2% | OmniVision, Neuhausen, Switzerland | n.a. | Methocel 2% |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A5040 | Tricaine, MS-222 |
| Visulas 532s | Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Germany | n.a. | 532 nm laser |
| Mouse anti-GS monoclonal antibody | Millipore, Billerica, MA, USA | MAB302 | |
| HRA + OCT Imaging System | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Spectralis |
| Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Version 1.9.10.0 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Rabbit anti-GFAP polyclonal antibody | Invitrogen, Waltham, MA, USA | 180063 | |
| Silicone pin holder | Huco Vision AG Switzerland | n.a. | Cut by hand from silicone pin mat of the sterilization tray accordingly. |
| Slit lamp BM900 | Haag-Streit AG, Koeniz, Switzerland | n.a. | |
| Slit lamp adapter | Iridex Corp., Mountain View, CA, USA | n.a. | |
| Superfrost Plus glass slides | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany | 10149870 | |
| TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain | KIT, Karlsruhe, Germany | 15204 | http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3 |
| Tris buffered saline (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5912 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P1379 | |
| 78D non-contact slit lamp lens | Volk Optical, Mentor, OH, USA | V78C | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 534056 | |
| Ocular fundus laser lens | Ocular Instruments, Bellevue, WA, USA | OFA2-0 | |
| 2100 Retriever | Aptum Biologics Ltd., Southampton, United Kingdom | R2100-EU | Steamer |
Referenzen
- Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).
- Stefano Ferrari, S., Di Iorio, E., Barbaro, V., Ponzin, D., Sorrentino, F. S., Parmeggiani, F. Retinitis Pigmentosa: Genes and Disease Mechanisms. Curr Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).
- Berson, E. L. Retinitis pigmentosa. The Friedenwald Lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (5), 1659-1676 (1993).
- Strettoi, E. A Survey of Retinal Remodeling. Front Cell Neurosci. 9, 494 (2015).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368, 1795-1809 (2006).
- Wang, D. Y., Chan, W. M., Tam, P. O., Baum, L., Lam, D. S., Chong, K. K., Fan, B. J., Pang, C. P. Gene mutations in retinitis pigmentosa and their clinical implications. Clin Chim Acta. 351 (1-2), 5-16 (2005).
- Pierce, E. A. Pathways to photoreceptor cell death in inherited retinal degenerations. BioEssays. 23, 605-618 (2001).
- Tackenberg, M. A., Tucker, B. A., Swift, J. S., Jiang, C., Redenti, S., Greenberg, K. P., Flannery, J. G., Reichenbach, A., Young, M. J. Muller cell activation, proliferation and migration following laser injury. Mol. Vis. , 1886-1896 (2009).
- Newman, E., Reichenbach, A. The Müller cell: a functional element of the retina. Trends Neurosci. 19 (8), 307-312 (1996).
- Kubota, R., Hokoc, J. N., Moshiri, A., McGuire, C., Reh, T. A. A comparative study of neurogenesis in the retinal ciliary marginal zone of homeothermic vertebrates. Brain Res Dev Brain Res. 134, 31-41 (2002).
- Zhao, T. T., Tian, C. Y., Yin, Z. Q. Activation of Müller cells occurs during retinal degeneration in RCS rats. Adv Exp Med Biol. 664, 575-583 (2010).
- DiCicco, R. M., Bell, B. A., Kaul, C., Hollyfield, J. G., Anand-Apte, B., Perkins, B. D., Tao, Y. K., Yuan, A. Retinal Regeneration Following OCT-Guided Laser Injury in Zebrafish. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (10), 6281-6288 (2014).
- Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. Int. J. Dev. Neurosci. , 621-629 (2001).
- Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Müller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).
- Yurco, P., Cameron, D. A. Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish. Vision Res. 45, 991-1002 (2005).
- Ashutosh, P. J., Roesch, K., Cepko, C. L. Development and neurogenic potential of Müller gial cells in the vertebrate retina. Prog Retin Eye Res. 28 (4), 249-262 (2009).
- Xia, X., Ahmad, I. Unlocking the Neurogenic Potential of Mammalian Müller Glia. Int J Stem Cells. 9 (2), 169-175 (2016).
- Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C., Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. , 7-38 (2002).
- Riepe, R. E., Norenburg, M. D. Müller cell localisation of glutamine synthetase in rat retina. Nature. 268 (5621), 654-655 (1977).
- Derouiche, A., Rauen, T. Coincidence of L-glutamate/L-aspartate transporter (GLAST) and glutamine synthetase (GS) immunoreactions in retinal glia: evidence for coupling of GLAST and GS in transmitter clearance. J Neurosci Res. 42 (1), 131-143 (1995).
- Bignami, A., Dahl, D. The radial glia of Müller in the rat retina and their response to injury. An immunofluorescence study with antibodies to the glial fibrillary acidic (GFA) protein. Exp Eye Res. 28 (1), 63-69 (1979).
- Sherpa, T., Fimbel, S. M., Mallory, D. E., Maaswinkel, H., Spritzer, S. D., Sand, J. A., Li, L., Hyde, D. R., Stenkamp, D. L. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev Neurobiol. 68 (2), 166-181 (2008).
- Cameron, D. A., Carney, L. H. Cell mosaic patterns in the native and regenerated inner retina of zebrafish: implications for retinal assembly. J Comp Neurol. 416 (3), 356-367 (2000).
- Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. BMC Dev Biol. 6, 36 (2006).
- Bailey, T. J., Davis, D. H., Vance, J. E., Hyde, D. R. Spectral-domain optical coherence tomography as a noninvasive method to assess damaged and regenerating adult zebrafish retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 3126-3138 (2012).
- Koinzer, S., Saeger, M., Hesse, C., Portz, L., Kleemann, S., Schlott, K., Brinkmann, R., Roider, J. Correlation with OCT and histology of photocoagulation lesions in patients and rabbits. Acta Ophthalmol. 91 (8), e603-e611 (2013).
- Wan, J., Zheng, H., Chen, Z. L., Xiao, H. L., Shen, Z. J., Zhou, G. M. Preferential regeneration of photoreceptor from Müller glia after retinal degeneration in adult rat. Vision Res. (2), 223-234 (2008).
- Thomas, J. L., Thummel, R. A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish. J Vis Exp. (80), e51017 (2013).
